郝貴杰，盛鵬程，林 鋒，潘曉藝，徐 洋，姚嘉赟，尹文林，曹 錚，袁雪梅，藺凌云，沈錦玉

(1．浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州 313001;2．寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

0 引言

草魚是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一，其主要疾病——草魚出血病能夠引起草魚大批死亡，嚴(yán)重影響我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，其病原為草魚呼腸孤病毒 (grass carp reovirus，GCRV)．GCRV為呼腸孤病毒科水生呼腸孤病毒屬成員中毒力最強(qiáng)的病毒[1]．該病流行于我國(guó)各地養(yǎng)殖區(qū)，死亡率可達(dá)50%～80%，每年可造成數(shù)萬(wàn)噸草魚產(chǎn)量的損失，嚴(yán)重影響我國(guó)草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展．目前對(duì)于該病毒還沒有特效的治療方法，早期快速診斷草魚GCRV是目前草魚養(yǎng)殖的主要預(yù)防措施和減少草魚損失的有效途徑．經(jīng)典的草魚呼腸孤病毒 (GCRV)檢測(cè)方法包括用細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)增分離、純化病毒檢測(cè)、電鏡觀察，但這些方法既費(fèi)力又耗時(shí)．隨著技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了其他的檢測(cè)方法，如免疫酶染色法[2]、葡萄球菌協(xié)同凝集反應(yīng)[3]及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[4]，然而這些方法都有其局限性．

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR(polymerase chain reaction)是一種在20世紀(jì)90年代開始被廣泛使用的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，此法操作簡(jiǎn)便，可短時(shí)間內(nèi)在微量離心管中獲得數(shù)百萬(wàn)特異DNA序列的拷貝，目前，該技術(shù)己滲透到分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域．在水生動(dòng)物病毒病原檢測(cè)方面，也有多個(gè)報(bào)道[5－7]，早在1997年王鐵輝等[8]建立了檢測(cè)GCRV的RT－PCR方法，李軍等[9]也用該方法檢測(cè)了病毒攻毒后病魚組織中的病毒，但是他們的這個(gè)方法只能檢測(cè)草魚呼腸孤病毒的一株病毒，即GCRV－861．2004年，Seng等[10]報(bào)道了在水生呼腸孤病毒S6基因片段的保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)兼并引物并建立了RT－PCR方法檢測(cè)水生呼腸孤病毒，取得了較好的結(jié)果．本試驗(yàn)根據(jù)GenBank已發(fā)表的GCRV及其他水生呼腸孤病毒的第六基因片段，在保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)GCRV特異性引物，以期建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏及廣譜的檢測(cè)草魚呼腸孤病毒的RT－PCR的方法，為草魚GCRV的快速診斷、病原調(diào)查及常規(guī)檢測(cè)提供技術(shù)支撐．

1 材料與方法

1.1 材料

1)毒株及細(xì)胞來(lái)源 試驗(yàn)選用一株已完成全部基因組序列測(cè)定的草魚呼腸孤病毒作為標(biāo)準(zhǔn)參考株，草魚腎細(xì)胞系[11](CIK)由長(zhǎng)江所惠贈(zèng)．

2)工具酶和試劑 Taq酶、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶 (AMV)、RNase抑制劑均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，Trizol、DEPC、DMEM培養(yǎng)基為Sigma公司產(chǎn)品，PCR純化試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，其他試劑為分析純．引物合成在invitrogen(上海)英駿生物技術(shù)有限公司完成．

1.2 方法

1)細(xì)胞培養(yǎng)及病毒傳代 ①細(xì)胞傳代:把已長(zhǎng)成致密單層的草魚CIK細(xì)胞系，用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶和0.02%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙二胺四乙酸二鈉混合消化液消化約5 min，然后倒掉消化液，再加入細(xì)胞生長(zhǎng)液，用吸管吹打分散細(xì)胞，最后分裝細(xì)胞瓶 (3 cm×6 cm)，使細(xì)胞傳代接種量為2.5×105·mL－1，待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿單層時(shí)用于病毒接種．②病毒傳代:將病毒培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次，凍融液按5%(體積分?jǐn)?shù))的比例接種于已長(zhǎng)成單層的CIK細(xì)胞，28℃孵育1 h后倒去病毒液，然后加入維持液 (含2%(體積分?jǐn)?shù))小牛血清的DMEM培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)不接毒的CIK細(xì)胞作為陰性對(duì)照．24 h后開始觀察細(xì)胞病變 (CPE)，CPE出現(xiàn)80%(體積分?jǐn)?shù))以上時(shí)收獲．

2)引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn) [10，12]，在GCRV第6基因片段設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物:P1，5'-ATC-CCGTATATCTATGGCTT－3';P2，5'-TTGGAGACGAACATAGACGC-3'，預(yù)期片段436 bp．

3)組織及細(xì)胞感染病毒RNA的提取及RT反應(yīng) 參照文獻(xiàn) [12－13]的方法進(jìn)行．

4)PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 ①引物濃度的優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系總體積為50μL:10×PCR Buffer(含Mg2+)5.0 μL，dNTP 4 μL，Taq DNA聚合酶2.5 U，上下游引物終濃度分別為1、40、80、120、160、200 nmol/L，反轉(zhuǎn)錄模板1.0 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)足余下體積．反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性4 min，94℃變性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸50 s，共進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸10 min，12℃保存．以1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)．②退火溫度的優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系同①．反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性4 min;其循環(huán)參數(shù)為94℃變性50 s，分別于56、54、52、50、48℃退火50 s，72℃延伸50 s，共進(jìn)行33個(gè)循環(huán);最后再72℃延伸10 min，12℃保存．PCR產(chǎn)物以1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)．

5)特異性試驗(yàn) 分別選取嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)BSK－10、WSSV、正常細(xì)胞作為測(cè)試對(duì)象，應(yīng)用建立的RT－PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以測(cè)定其特異性．

6)敏感性試驗(yàn) 根據(jù)5)中的方法制備細(xì)胞培養(yǎng)病毒液的RNA并反轉(zhuǎn)錄，然后將cDNA模板作5倍倍比稀釋，取不同稀釋度的模板DNA各1 μL分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增．

7)在養(yǎng)殖草魚病害檢測(cè)中的應(yīng)用 分別在2007年和2008年在草魚出血病流行季節(jié)，從江西蓮塘魚種養(yǎng)殖地及湖州郊區(qū)采集病魚共5份，按3)的方法提取病魚肝脾腎組織中的病毒RNA，用4)的RT－PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合細(xì)胞分離及理化特性鑒定進(jìn)行驗(yàn)證．

8)病毒分離 參照文獻(xiàn) [14]的方法進(jìn)行，用CIK細(xì)胞系進(jìn)行病毒培養(yǎng)與分離．

9)病毒的鑒定 將細(xì)胞分離培養(yǎng)的病毒進(jìn)行差速及超速離心、純化，負(fù)染后進(jìn)行電鏡觀察、拍照．參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行測(cè)定，分別取一定量的病毒培養(yǎng)液，按一定比例加入乙醚或氯仿，經(jīng)過(guò)處理后，測(cè)定處理組和對(duì)照組病毒液的組織細(xì)胞半數(shù)感染量 (TCID50)．

2 結(jié)果

2.1 RNA提取

采用分光光度計(jì)測(cè)定所提取樣品的總RNA OD260/OD280的比值，均在1.8～2.0之間，這表明，所提取的總RNA中無(wú)蛋白質(zhì)和氛類物質(zhì)的干擾，其純度較高，可以達(dá)到檢測(cè)要求的純度．

2.2 RT－PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 引物濃度的優(yōu)化

按6種不同引物濃度，采用GCRV參考標(biāo)準(zhǔn)株核酸的反轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示．上下游引物濃度分別為120 nmol/L和120 nmol/L時(shí)擴(kuò)增效果最佳．

2.2.2 退火溫度的優(yōu)化

根據(jù)所設(shè)計(jì)引物的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了5個(gè)退火溫度，其電泳結(jié)果如圖2所示，可以看出，退火溫度在50℃、52℃和54℃時(shí)，目的基因得到有效擴(kuò)增，由于52℃時(shí)，擴(kuò)增條帶最為清晰，因此選52℃為優(yōu)化后的退火溫度．

2.3 RT－PCR的特異性

提取本實(shí)驗(yàn)室保存的嗜水氣單胞菌BSK－10、WSSV的核酸、GCRV標(biāo)準(zhǔn)參考株及正常CIK細(xì)胞的RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，分別作為PCR擴(kuò)增的模板，以測(cè)定PCR引物的特異性．PCR體系和條件參照方法4)的優(yōu)化結(jié)果．?dāng)U增結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明該對(duì)引物特異性很好．

2.4 RT－PCR的敏感性

將GCRV的反轉(zhuǎn)錄模板作5倍倍比稀釋，當(dāng)稀釋至5－7時(shí)，PCR結(jié)果還為陽(yáng)性，結(jié)果見圖4．

圖1 不同引物濃度的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results using different primers concentration

圖2 不同退火溫度的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR results under different annealing

圖3 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 PCR specificity test

圖4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 PCR sensitivity test

圖5RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The results of RT-PCR detection

2.5 疑似GCRV感染草魚病樣的檢測(cè)

用本RT－PCR方法對(duì)江西蓮塘魚種養(yǎng)殖地及湖州郊區(qū)采集的1份病魚樣 (肝、脾、腎)的研磨勻漿進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果 (見圖5)有3份樣品 (分別為JX2007、JX2008和HZ2008)在436 bp處有1條帶，顯示GCRV結(jié)果為陽(yáng)性;2份為陰性 (分別為HZ07和HZ08)．

2.6 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果

將采集到的疑似GCRV感染草魚的5份病樣，接種CIK細(xì)胞，RT－PCR檢測(cè)結(jié)果 (見圖6)為陽(yáng)性的樣品均在病毒感染單層細(xì)胞后24～36 h，細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，病變形態(tài)和文獻(xiàn)[14]的描述一致．

2.7 細(xì)胞培養(yǎng)病毒的RT－PCR檢測(cè)結(jié)果

將CIK細(xì)胞分離為陽(yáng)性的病毒樣品，按照方法3)提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，用所建立的RT－PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示．

2.8 病毒鑒定結(jié)果

在電子顯微鏡下觀察到，提純的病毒顆粒大小均一、近似球形、二十面體，直徑約75 nm(見圖8)，是呼腸孤病毒的特征．

圖6 病毒感染細(xì)胞病變結(jié)果Fig.6 The CPE result of CIK cells infected by virus

圖7 細(xì)胞培養(yǎng)病毒RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.7 RT-PCR detection of virus in CIK cells

圖8 提純的病毒顆粒 （120 000×）Fig.8 The purified virus particles

3株分離株對(duì)氯仿、乙醚的敏感性試驗(yàn)結(jié)果見表1．結(jié)果表明:氯仿、乙醚處理組病毒的平均組織細(xì)胞半數(shù)感染量 (TCID50)變化不大，即病毒的感染力和對(duì)照組相比并沒有多大變化，說(shuō)明所分離的病毒對(duì)氯仿和乙醚有一定的抗性．

表1 氯仿、乙醚對(duì)3株分離株的影響Tab．1 Effects of chloroform and ether on three virus isolates

3 討論

本研究參考了文獻(xiàn) [12]，并參考Genbank中的GCRV序列，在其S6基因片段保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性擴(kuò)增GCRV的引物，建立了RT－PCR技術(shù)．用RT－PCR檢測(cè)RNA的過(guò)程中，不但RNA的抽提方法對(duì)結(jié)果有影響，所選擇的退火溫度、引物濃度等對(duì)其結(jié)果也均有影響．通過(guò)優(yōu)化PCR體系，得出最適的上下游引物濃度分別為120 nmol/L和120 nmol/L，最佳的退火溫度為52℃．特異性實(shí)驗(yàn)表明，分別用所提取本實(shí)驗(yàn)室保存的嗜水氣單胞菌BSK－10、WSSV的核酸、GCRV標(biāo)準(zhǔn)參考株及正常CIK細(xì)胞的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，作為PCR擴(kuò)增的模板，結(jié)果只有GCRV陽(yáng)性有特異條帶，其他全無(wú)特異性條帶，這說(shuō)明所設(shè)計(jì)的該對(duì)引物特異性很好．敏感性實(shí)驗(yàn)表明，將GCRV的反轉(zhuǎn)錄模板作5倍倍比稀釋，當(dāng)稀釋至5－7時(shí) (dsRNA為9×10－8μg時(shí))，PCR結(jié)果還為陽(yáng)性，說(shuō)明敏感性較好．針對(duì)草魚出血病進(jìn)行病原檢測(cè)，最快可以在8 h內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，從發(fā)病草魚樣品中確診GCRV病原．利用所建立的RT－PCR方法共檢測(cè)了5份疑似樣品，結(jié)果有3份為陽(yáng)性，2份為陰性．為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)采用CIK細(xì)胞分離的方法對(duì)所采5份病樣進(jìn)行了病毒分離，其中RT－PCR鑒定為陽(yáng)性的病樣濾液在感染單層細(xì)胞后24 h，細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，病變過(guò)程和標(biāo)準(zhǔn)參考株病變一致[14]．進(jìn)一步提取感染病毒細(xì)胞液的RNA進(jìn)行RT－PCR，也全部為陽(yáng)性．從純化病毒的電鏡觀察及理化特性分析結(jié)果可以看出，氯仿、乙醚處理組病毒的感染力和對(duì)照組相比變化不大，說(shuō)明所分離的3株病毒對(duì)氯仿和乙醚有一定的抗性．這種理化特性可作為此病毒不存在囊膜的證據(jù)，該結(jié)果與柯麗華等[15]報(bào)道的一致．

綜上所述，本試驗(yàn)建立了一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)草魚呼腸孤病毒的RT－PCR的方法．體內(nèi)外研究都表明，該方法與傳統(tǒng)的方法相比，具有靈敏性和特異性好并且耗時(shí)少的特點(diǎn)，而且和以往的草魚呼腸孤病毒的RT－PCR方法比較，具有較好的光譜性．因此，該方法的建立為草魚呼腸孤病毒的快速診斷、病原調(diào)查及常規(guī)檢測(cè)提供了技術(shù)支撐．

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