孔漢金，張克山，劉永杰，尚佑軍，吳 斌，劉湘濤

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室 國家口蹄疫參考實驗室 蘭州730046；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，武漢 430070）

綿羊肺腺瘤（ovine pulmonary adenomatosis,OPA）是由外源性綿羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒（exogenous Jaagsiekte sheep retrovirus, exJSRV）引起的成年綿羊慢性、進(jìn)行性、接觸傳染性肺臟疾病[1]。除了大洋洲外，本病已在全球各地發(fā)生[2]。該病潛伏期長，病羊臨床主要表現(xiàn)為咳嗽，呼吸困難，大量漿液性鼻漏，病理學(xué)表現(xiàn)為肺泡和支氣管上皮出現(xiàn)腫瘤性增生等典型特征[3]。JSRV感染綿羊后，在自身編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶作用下形成了前病毒及其兩端的長末端重復(fù)序列（LTR）, 并通過整合酶整合到宿主細(xì)胞基因組中暫時或長期存在[4]。前病毒DNA編碼區(qū)內(nèi)有典型反轉(zhuǎn)錄病毒相互重疊的gag，pol，pro，env基因結(jié)構(gòu)[5]。

幾乎所有真核生物中都存在有與水平傳播的致病性外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒相對應(yīng)的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（Endogenous ret-rovirus，ERVs），ERVs是遠(yuǎn)古反轉(zhuǎn)錄病毒感染宿主種系后并可垂直傳播的宿主基因組中的基因片段[6,7]。關(guān)于ERVs 的功能目前仍不完全清楚，在正常綿羊和山羊基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)含有15～20 拷貝的與exJSRV 序列密切相關(guān)的內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒（endogenous Jaagsiekte sheepretrovirus，enJSRV）, 在每個特定物種的個體中都存在[8]。enJSRV基因組結(jié)構(gòu)包括兩端非編碼區(qū)（5′, 3′LTR）及gag, pol, pro, env等 4 個編碼基因。JSRVenv基因編碼病毒囊膜前體蛋白經(jīng)水解后產(chǎn)生表面蛋白（SU）和跨膜蛋白（TM）[9]。Exenv與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞Hyal2受體結(jié)合，激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)特異性轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化的發(fā)生和病毒大量增殖從而誘發(fā)OPA腫瘤形成[10]。研究表明外源性env基因是JSRV誘導(dǎo)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的必需基因[11]，但所有內(nèi)源性env基因不能誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[12]。Exenv與外源性Enenv有著相同的受體Hyal2，可通過競爭性與受體結(jié)合阻止exJSRV感染。而且研究證實Enenv在孕體發(fā)展和胎盤形態(tài)發(fā)生過程中扮演重要生理角色[13,14]。

本文克隆并測定了Enenv序列，進(jìn)行了Enenv和Exenv核苷酸、推導(dǎo)的氨基酸、基因結(jié)構(gòu)及其蛋白B細(xì)胞表位比較分析，為進(jìn)一步深入探究env功能提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料山東某羊場健康綿羊肺臟。ExTaqDNA 聚合 酶、dNTP、IPTG、X-gal、DNA Marker DL2000,pMD18-T 購自寶生物工程有限公司；Tissue／blood DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒購自ENZA公司。

1.2 綿羊基因組DNA的提取取綿羊肺臟樣品約100 mg 置于研缽中，加入液氮研成粉末，參照組織基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN）說明書的要求和步驟，提取總DNA。經(jīng)紫外分光光度計檢測濃度和純度，-80℃保存。

1.3 引物設(shè)計 基因擴(kuò)增參照GenBank公布的內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒env（AF153615）基因序列，應(yīng)用primer 5.0軟件設(shè)計如下引物。上引物:TTCAGCAGCCCAGCGATTT；下引物:AGGG AGCTTAGGTACTTGTCC，均由上海生物工程有限公司合成。以1.2提取的DNA為模板，加入上游引物和下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系:模板5 uL，premix ExTaq25 uL， 上 下 引 物 各 1 uL，ddH2O 補充至 50 uL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 1 min，55℃退火 45 s，72℃延伸 3 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，取反應(yīng)液5～10 uL，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（ENZA）說明，將PCR 產(chǎn)物切膠回收純化，與pMD18-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含氨芐青霉素、X-gal和IPTG的選擇平板上培養(yǎng)12～16 h, 然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落接種含LB的細(xì)菌瓶，搖床培養(yǎng)6 h后進(jìn)行菌液PCR鑒定。擴(kuò)增條件和反應(yīng)參數(shù)與上述PCR反應(yīng)相同。

1.4 序列測定和遺傳進(jìn)化分析將上述PCR鑒定陽性的菌株送上海美吉測序公司測序，應(yīng)用DNAStar軟件通過Cluster W方法對測得的基因序列和GenBank公布的參考序列分別進(jìn)行核苷酸和氨基酸水平的同源性分析和構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.5 Enenv和Exenv蛋白結(jié)構(gòu)與功能比較分析

1.5.1 Enenv和Exenv蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析 以外源性綿羊肺腺瘤病毒美國代表株JSRV21（AF105220）env基因作為Exenv用于本次研究的比較對象，運用在線Expasy工具ProtParam分析Enenv和Exenv所編碼的蛋白分子理化特性。利用DNAStar元件的Kyte_Doolittle方法預(yù)測兩者編碼蛋白的親水性和疏水性，利用TMHMM2.0和Expasy中的SOSUI和SignalIP分析工具預(yù)測兩者編碼蛋白的跨膜區(qū)以及信號肽。

1.5.2 Enenv和Exenv蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析 利用DNAStar 分析軟件對Enenv和Exenv進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測并作比較分析。利用Emini軟件對氨基酸序列的帶電量, 表面暴露區(qū)進(jìn)行分析。綜合考慮蛋白質(zhì)親水性，表面可能性，抗原性指數(shù)等參數(shù)，確定兩基因編碼蛋白的B細(xì)胞抗原優(yōu)勢表位。

1.5.3 Enenv和Exenv蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與功能分析 含有保守氨基酸序列的基序組成結(jié)構(gòu)域，是蛋白質(zhì)序列功能，結(jié)構(gòu)和進(jìn)化的單元。利用簡單模塊構(gòu)架搜索工具（SMART）和Interpro數(shù)據(jù)庫預(yù)測和比較分析Enenv和Exenv所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能域。

1.5.4 Enenv和Exenv蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析 將Enenv和Exenv基因推導(dǎo)的氨基酸序列提交Swiss-Model，使用RasMol分析軟件得到兩者三維結(jié)構(gòu)模型并進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化分析PCR擴(kuò)增得到大小約2000 bp的基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖略），序列測定結(jié)果表明Enenv基因大小為1836 bp，編碼611個氨基酸，GC含量為39.22%。將該基因序列提交GeneBank，獲得序列號為（JX843793），命名為enJSRV-SD。從Genbank上獲得外源性env參考序列美國代表株JSRV21，分析發(fā)現(xiàn)Exenv基因全長1848 bp，編碼615個氨基酸，GC含量41.18%。Enenv和Exenv的核苷酸同源性為88.1%，差異主要集中在1200～1795區(qū)段，位于env基因的TM區(qū)，多為單個堿基的改變，且發(fā)現(xiàn)Enenv和Exenv相比在1756～1770區(qū)段缺失了一段序列。Enenv和Exenv推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為92.0%，兩者主要差異位于478～599區(qū)段，Exenv氨基酸序列TM區(qū)發(fā)現(xiàn)有YRNM序列，而Enenv在相同位置為XKNM，在其他區(qū)段也未發(fā)現(xiàn)致病exJSRV特有的YXXM基序。

將本次測得的內(nèi)源性env序列與Genbank公布的其他內(nèi)源性和外源性env序列進(jìn)行比較分析。本次測定的Enenv與國內(nèi)外發(fā)布的enJSRVenv基因推導(dǎo)的氨基酸水平同源性為97.2%～99.2%；與內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒南非代表株enJS56A1（AFl53615）的氨基酸同源性最高為99.2%；與exJSRVenv的同源性較低，推導(dǎo)的氨基酸水平同源性為91.5%～92.0%。且與同屬山羊動物鼻腫瘤病毒env基因（AY197548）推導(dǎo)的氨基酸同源性為89.4%（圖1）。通過遺傳進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn)本次克隆的Enenv基因與AFl53615參考毒株親源關(guān)系最近，處于同一分支（圖2）。

2.2 Enenv和Exenv蛋白結(jié)構(gòu)與功能比較分析

2.2.1 Enenv和Exenv蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析 蛋白一級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)Enenv和Exenv兩者在蛋白分子量，理論等電點，正負(fù)電氨基酸個數(shù)，脂肪系數(shù)和半衰期以及總平均疏水指數(shù)等理化性質(zhì)上具有相似的特性。但兩者的不穩(wěn)定系數(shù)有所不同，根據(jù)Protparam定義，不穩(wěn)定系數(shù)分值小于40的蛋白穩(wěn)定，表明內(nèi)源性env蛋白不穩(wěn)定（V:40.68），而Exenv穩(wěn)定（V:36.66）。用Kyte-Doolittle法進(jìn)行親水性分析發(fā)現(xiàn)Enenv和Exenv具有較強(qiáng)的親水性，由圖3可看出兩者親水區(qū)主要都集中在為1～57、97～108、142～151、169～184、228～243、427～438、453～494、592～612等8個區(qū)段。使用SOSUI元件分析發(fā)現(xiàn)Enenv和Exenv蛋白都含有兩個跨膜區(qū)，且在相同位置處（381～403、548～570）（圖 4）。使用big-PI Predictor元件預(yù)測兩蛋白都未發(fā)現(xiàn)GPI位點，使用Signal IP分析表明兩者也都無信號肽。

圖1 enJSRV 和 exJSRV 各代表株間氨基酸同源性分析Fig.1 The identity of enJSRV and exJSRV amino acid sequences of different strains

圖2 enJSRV 和 exJSRV 各代表株間氨基酸水平系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The Phylogenetic tree for different strains of enJSRV and exJSRV amino acid sequences

2.2.2 Enenv和Exenv蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析 Enenv推導(dǎo)的蛋白在第350～369區(qū)段，第505～517區(qū)段和第573～606區(qū)段為α螺旋區(qū)域；β折疊區(qū)域有43個區(qū)段，不規(guī)則地分布于整個Enenv蛋白；有28個轉(zhuǎn)角區(qū)域和26個無規(guī)則卷曲區(qū)域。Exenv和Enenv二級結(jié)構(gòu)基本相似，不同的是Exenv在第540～560區(qū)段只有1個α螺旋區(qū)域，而Enenv有2個，但enJSRV-SD在第25位置處多出1個α螺旋區(qū)域；Enenv在第520～600區(qū)段的β折疊區(qū)域分布明顯要比Exenv密集，且Exenv在第610處多1個轉(zhuǎn)角區(qū)域（圖5）。

2.2.3 Enenv和Exenv蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與功能分析 結(jié)果表明Enenv和Exenv蛋白結(jié)構(gòu)域極其相似，都含有1個GP41結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在Enenv蛋白中位于第399-608區(qū)段，而在Exenv蛋白中位于399～597。Enenv蛋白都含有2個跨膜結(jié)構(gòu)域，且分布在第381-403、548-570區(qū)段，經(jīng)SMART分析發(fā)現(xiàn)由于該區(qū)段有其他結(jié)構(gòu)域覆蓋而未顯現(xiàn)出來。Enenv和Exenv蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的抗原表位分析結(jié)果見圖6。綜合α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)少、富含β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域，選擇抗原性指數(shù)（antigenicity）大于0、親水性（hydrophilicity）指數(shù)大于0、氨基酸位于蛋白分子表面可能性大于1并且鄰近柔性結(jié)構(gòu)等參數(shù)，Enenv蛋白的B細(xì)胞表位可能位于30-35、171-175、178-181、228-233、237-243、477-479和608-610氨基酸區(qū)域內(nèi)或附近。Exenv蛋白的B細(xì)胞表位與Enenv蛋白基本相同，可能位于16-20、30-35、178-181、228-233、477-479和 608-610氨基酸區(qū)域內(nèi)或附近。

2.2.4 Enenv和Exenv蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析 將內(nèi)外源性env基因推導(dǎo)的氨基酸序列提交Swiss-Model, 使用PyMOL顯示工具得到其三維結(jié)構(gòu)模型（圖7）。兩者預(yù)測的三維模型結(jié)構(gòu)基本相似，從圖中可明顯看到Exenv蛋白比Enenv蛋白在肽鏈末端多出1個α螺旋。

圖3 Enenv(A)和Exenv(B)蛋白親水性（Kyte-Doolittle法）Fig.3 The hydrophilicity plot of Enenv(A) protein and Exenv(B) protein

圖4 內(nèi)源性env(A)和外源性env(B)編碼蛋白的跨膜區(qū)Fig.4 The transmembrane domain of Enenv(A) protein and Exenv(B) protein

圖5 內(nèi)源性env（Ⅰ）和外源性env（Ⅱ）蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（Gamier-Robson 方法）Fig.5 Secondary structure of Enenv(Ⅰ )and Exenv(Ⅱ )protein predicted by the method of Gamier-Robson

圖6 內(nèi)源性env(A)和外源性env(B) 蛋白的親水性、抗原指數(shù)及其表面可能性分析Fig.6 Analysis of hydrophilicity plot, antigenic index and surface probability of the Enenv(A) protein and Exenv(B) protein

圖7 內(nèi)源性env（A）和外源性env（B）蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測圖（帶狀結(jié)構(gòu)）Fig.7 The predicted 3-D structure for env protein of Enenv and Exenv generated by PyMOL（Ribbons model）

3 討論

本研究以山東某羊場健康羊肺臟組織提取的基因組DNA為模板擴(kuò)增enJSRV的env基因，測序后預(yù)測其二三級蛋白結(jié)構(gòu)和抗原表位并與外源性綿羊肺腺瘤病毒美國代表株JSRV21 env作比較分析。序列分析發(fā)現(xiàn)Enenv和Exenv在核苷酸水平和結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白的特征上具有一定的差異。對內(nèi)外源性env基因核苷酸序列比較發(fā)現(xiàn)兩者的突變位置主要發(fā)生在env基因的TM區(qū)，這與文獻(xiàn)報道的exJSRV與enJSRV之間的核苷酸序列變異集中在LTR 的U3 和Env基因的TM區(qū)相一致[9]，且符合反轉(zhuǎn)錄病毒變異的一般規(guī)律。

遺傳進(jìn)化樹分析顯示enJSRV-SD與古老型enJS56A1（AF153615）處在同一分支，具有較近的親緣關(guān)系，可見至今我國山東綿羊染色體上保留的enJSRV-SD是古老型的，遺傳相對穩(wěn)定。還發(fā)現(xiàn)參與序列比較的內(nèi)外源性綿羊肺腺瘤病毒分別處于兩個不同的大的進(jìn)化分支上，這也在一定程度上可以作為區(qū)別內(nèi)外源性綿羊肺腺瘤鑒定診斷方法之一[5]。在所有的外源性肺腺瘤病毒env蛋白的胞質(zhì)尾部包含高度保守的YXXM基序，酪氨酸（Y）磷酸化后作為PI3K/p85調(diào)節(jié)亞基的結(jié)合位點，外源性肺腺瘤病毒可通過env蛋白的胞質(zhì)尾與其相應(yīng)受體結(jié)合誘導(dǎo)靶細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞增生癌變。而無轉(zhuǎn)化特性的內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒的env蛋白無此基序[15]。本次研究擴(kuò)增的Enenv基因推導(dǎo)的氨基酸序列為HKNM支持了這一結(jié)論。

目前預(yù)測蛋白質(zhì)疏水性最為廣泛的方法是Kyte-Doolittle法。內(nèi)外源性env基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)總平均疏水指數(shù)（GRAVY ）分別為-0.044和-0.041，表明內(nèi)外源性env蛋白都為親水性?？缒^(qū)預(yù)測發(fā)現(xiàn)內(nèi)外源性env蛋白都含有兩個跨膜區(qū)，并且分布位置大致相同，env基因編碼前體蛋白經(jīng)水解后產(chǎn)生TM和SU，而TM實質(zhì)是env蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。

對內(nèi)外源性env蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)兩者也極為相似，這說明兩者可能具有某些相似的功能。結(jié)構(gòu)域功能比較分析發(fā)現(xiàn)兩者都含有GP41蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域常常存在于各種逆轉(zhuǎn)錄病毒的囊膜蛋白上，比如HIV和SIV的囊膜蛋白的GP41亞基，其作用是調(diào)控病毒入侵階段的膜融合[16]，其蛋白衍生物可以阻止HIV-1進(jìn)入人類CD4+細(xì)胞和其他細(xì)胞系，目前該蛋白已成為研發(fā)抵抗HIV和相似逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因治療研究的熱點[17]。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析與表位分布有較大關(guān)系，螺旋區(qū)段及折疊區(qū)段因其結(jié)構(gòu)規(guī)則，有氫鍵維持結(jié)構(gòu)，不易形變，主要起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)作用，而轉(zhuǎn)角區(qū)域和無規(guī)則卷曲區(qū)域多位于球蛋白分子表面，在此改變多肽鏈方法的阻力較小，故易于形變，有利于與抗體結(jié)合，從而成為抗原表位的可能性較大。綜合考慮這幾種因素，預(yù)測發(fā)現(xiàn)內(nèi)外源性env蛋白的B細(xì)胞抗原表位分布位置也大致相同。Env蛋白作為exJSRV的囊膜成分，存在潛在的黏多糖結(jié)合位點。然而對于JSRV感染，機(jī)體缺乏針對病毒蛋白的特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答[2]，這可能是由于綿羊在胸腺T淋巴細(xì)胞發(fā)育期間表達(dá)enJSRV env蛋白能與Hyal2結(jié)合從而造成了機(jī)體對JSRV的免疫耐受[18]。

內(nèi)外源性env蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)表明內(nèi)外源性env蛋白可能具有相同的受體，事實上兩者都可與受體Hyal2結(jié)合啟動機(jī)體內(nèi)細(xì)胞不同的信號途徑。enJSRV不僅參與綿羊形成針對exJSRV感染的免疫耐受，而且還與孕體發(fā)展有關(guān)。反芻動物的妊娠識別信號胎盤干擾素的分泌與enJSRV env蛋白和Hyal2結(jié)合有關(guān)，懷孕12 d時，enJSRV env轉(zhuǎn)錄和表達(dá)抑制會造成胚胎植入前發(fā)育期孕體的不正常擴(kuò)展，由固體形式變成絲狀，從而不能附著子宮壁上[19]。并且Enenv蛋白與其受體Hyal2共表達(dá)能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞融合促使巨細(xì)胞合胞體斑塊形成，而巨細(xì)胞合胞體斑塊又是胎盤形成的關(guān)鍵[20,21]。目前env蛋白與Hyal2在空間結(jié)構(gòu)作用的具體機(jī)制仍不清楚。Enenv的胞質(zhì)尾區(qū)沒有酪氨酸殘基序列YXXM以及其他部位的序列差異，這可能導(dǎo)致Enenv三維結(jié)構(gòu)與Exenv有著微小的差異，這種差異使得Enenv蛋白不能結(jié)合PI3K和激活A(yù)kt下游信號通路，最終導(dǎo)致Enenv蛋白無致瘤活性。本次研究通過對綿羊肺腺瘤內(nèi)、外源性env基因的比較分析，為內(nèi)外源性Env蛋白功能研究提供了線索，進(jìn)而為綿羊肺腺瘤病毒的致病機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。

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