董嘉文，孫敏華，李林林，袁建豐，鄺瑞歡，胡奇林

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣州 510640）

番鴨細(xì)小病毒病多發(fā)生于1～3周齡的雛番鴨，又稱為“三周病”，它是由番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus，MPV）引起的以呼吸困難、腹瀉、腳軟以及進(jìn)行性消瘦為主要癥狀的番鴨疫病[1,2]。番鴨細(xì)小病毒（MPV）屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，其基因組為單鏈線性 DNA，基因組全長為5132 bp，包含兩個主要開放閱讀框架（open reading frame, ORF），兩個 ORF 位于同一讀碼框內(nèi)[3]。左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS（NS1、NS2），編碼二者基因的起始密碼子的位置不同，但共用同一終止密碼子。NS1基因含有1884個核苷酸，編碼628個氨基酸，NS1蛋白參與病毒對細(xì)胞的毒性作用、病毒復(fù)制及基因表達(dá)[4]。NS2 蛋白能促進(jìn)NS1蛋白對細(xì)胞的毒性作用[5]?，F(xiàn)已證明NS1蛋白具有與ATP結(jié)合、ATPase活性、解旋酶活性等功能[6]。右側(cè) ORF 編碼病毒3種結(jié)構(gòu)蛋白分別是VP1、VP2 和VP3。目前關(guān)于番鴨細(xì)小病毒的研究主要集中在病毒的結(jié)構(gòu)蛋白上，而對非結(jié)構(gòu)蛋白的研究較少[7-9]。因此，本研究擴增了MPV NS1基因，進(jìn)行了克隆和序列分析，并成功表達(dá)和純化了具有生物學(xué)活性的NS1蛋白，為MPV診斷試劑盒、基因工程疫苗與NS1蛋白的結(jié)構(gòu)、功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒 菌株 質(zhì)粒和試劑MPV 佛山分離株（MPV FS）、MPV 多克隆抗體、大腸埃希菌工程菌株 DH5α、Rosseta 感受態(tài)細(xì)胞、pET32a ( + )質(zhì)粒，均為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所保存。BamH Ⅰ、XhoI 、T4 DNA 連接酶和 MiniBest病毒RNA/DNA抽提試劑盒購于寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購和小量質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生物科技有限公司；預(yù)染蛋白質(zhì)Marker為Fmentas公司產(chǎn)品，兔抗鴨IgG為Nordic公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計根據(jù) MPV FM 株 NS1基因序列（GenBank:U22967）， 利用 primer 5.0軟 件 設(shè)計一對NS1基因的特異性引物，預(yù)擴增片段長大約1900 bp，由上海英濰捷基生物技術(shù)公司合成，NS1-P1:5'-GCGGGATCCATGGCATTTTCTAGGC-3' (BamH I)，NS1-P2： 5'-GCGCTCGAG TTGTTCATTCTCCATATCA -3'（XhoI）。

1.3 MPV NS1基因的PCR擴增以提取的 MPV FS株DNA為模板進(jìn)行 PCR，25 μL PCR反應(yīng)體系:10×ExTaqbuffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mM）2.0 μL，P1（10 pmol/μL）1.0 μL ，P2（10 pmol/μL） 1.0 μL，ExTaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，DNA 2 μL，加 ddH2O 至 25 μL。反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，53℃退火30 s，72℃延伸 2 min，循環(huán) 30次；最后 72℃延伸10 min，10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物，回收目的片段。

1.4 目的基因的克隆與鑒定將回收的PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T-Simple 載體上，連接反應(yīng)體系:pMD18-T-Simple 1 μL、NS1 基因回收片段 4 μL和 Solution I 5 μL; 16℃連接過夜后轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，將培養(yǎng)液涂布于含 Amp（100 mg/ L）的平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑選單個菌落進(jìn)行菌落PCR，提取質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切鑒定正確后，將陽性克隆送上海英濰捷基生物技術(shù)公司測序。運用DNAStar 軟件對測序所得的序列與MPV FM株進(jìn)行相似性比較。

1.5 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將測序正確的pMD18-T-NS1陽性質(zhì)粒和原核表達(dá)載體 pET32a(+)分別用BamH Ⅰ和XhoI 雙酶切，分別回收酶切后的NS1片段與線性化后的pET32a (+)，加入T4-DNA連接酶于16℃連接過夜，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，將培養(yǎng)液涂布于含 Amp (100 mg/ L) 的平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑選單個菌落進(jìn)行菌落 PCR 和酶切鑒定。

1.6 重組菌在 Rosetta中的初步表達(dá)鑒定將pET32a-NS1陽性菌液按1：100比例加入5 mL含Amp 的LB液體培養(yǎng)基，37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)，等OD600值到0.5～0.8 時，取 1 mL 菌液于 1.5 mL 離心管中作為誘導(dǎo)前對照，加入 IPTG 至終濃度為 1.0 mmol/ L，誘導(dǎo)5 h 停止培養(yǎng)。將pET32a-NS1誘導(dǎo)菌、未誘導(dǎo)pET32a- NS1 菌液以及誘導(dǎo)的 pET32a (+)空載體 10 800×g離心 1 min，加入 50 μL PBS 重懸菌體，然后加入2×SDS 凝膠上樣緩沖液50 μL，沸水中煮10 min，10 800×g離心 1 min，取 10 μL 上清上樣進(jìn)行SDS-PAGE，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后分析。

1.7 重組蛋白的可溶性分析按照確定的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件對100 mL pET32a-NS1 陽性菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。首先將菌液 9000×g、4℃離心 10 min 收集菌體，加入20 mL PBS 重懸菌體，置冰浴中超聲破裂解菌。超聲完畢后 10 800×g、4℃離心 10 min，分別收集上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測和凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后分析蛋白的可溶性。

1.8 重組蛋白的提取及純化參照Novagen 公司的Ni-NTA His.Bind 操作說明進(jìn)行，離心收集 200 mL誘導(dǎo)宿主菌，加入20 mL PBS 重懸菌體，置冰浴超聲使菌體裂解至溶液清亮，離心棄上清，用 10 mL Binding Buffer（含 8 M 尿素）重懸菌體，冰浴 1 h后，4℃、 10 000 ×g離心 20 min，收集上清，即為溶解的包涵體。將1 mL 50%的Ni-NTA 樹脂懸浮液加到10 mL細(xì)胞裂解液中，輕柔混勻，室溫結(jié)合30 min，將混合液裝柱；然后分別用pH值為8.0、6.3、4.5的含8 M 尿素緩沖液洗脫柱子上的蛋白，并且每次都要收集流出液，用于SDS-PAGE電泳分析。

1.9 重組蛋白的Western blot檢測按照上述處理重組蛋白樣品并做SDS-PAGE，隨后將電泳蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，5V 轉(zhuǎn)印1 h后，NC 膜用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜；PBST 洗膜 3次，每次 5 min；1：50 稀釋MPV 多克隆抗體，37℃孵育1 h；PBST洗膜3次，每次 5 min；加入 1：2000 稀釋的 HRP 標(biāo)記的兔抗鴨IgG ，37℃孵育 1 h后洗膜 3次，每次 5 min；然后用DAB顯色進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴增MPV NS1 基因的 PCR 擴增產(chǎn)物電泳后，可見一條約 1900 bp 特異性的條帶，與預(yù)期片段大小相一致（見圖1）。運用 DNAStar 軟件對測序所得的序列與MPV FM 株進(jìn)行相似性比較發(fā)現(xiàn):MPV FS 株 NS1 基因核苷酸序列與 MPV FM 株（登錄號:U22967）相似性為99.3%，僅有13個堿基的差異；NS1 基因推導(dǎo)所得的氨基酸序列與以上毒株的相似性為98.4%，有10個氨基酸差異。

圖 1 MPV-NS1 基因 PCR 擴增Fig.1 PCR-amplifi ed NS1 gene from MPV

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將測序正確的NS1片段與表達(dá)載pET32a（+）連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta，挑取單菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，經(jīng)過BamHⅠ和XhoI 雙酶切鑒定，電泳可見兩條大小分別為 1900 bp 和5900 bp 清晰條帶，前者為 NS1基因，后者為pET32a (+) 載體片段，說明NS1基因正確插入到表達(dá)載體中（見圖2），將該重組質(zhì)粒命名為pET32a-NS1。

圖2 pET32a-NS1 質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Identifi cation of recombinant plasmid pET32a-NS1 by restriction enzymes digestion

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的SDS-PAGE分析重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-NS1轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，大約在92 kDa處出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白分子量大小一致，而對照泳道無該條帶（見圖3）。融合蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中，但上清中也有少量的融合蛋白（見圖4）。

2.4 Western blot檢測結(jié)果對pET32a-NS1重組蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示在92 kDa處出現(xiàn)一條特異條帶，說明純化重組蛋白在大腸桿菌中獲得正確表達(dá)，并且能被 MPV多克隆抗體所識別，表明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性（見圖5）。

圖4 pET32a-NS1表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析Fig.4 The analysis of solubility of pET32a-NS1 expression products

圖5 pET32a-NS1表達(dá)產(chǎn)物的Western blot 分析Fig.5 Western blot analysis of pET32a-NS1

3 討論

番鴨細(xì)小病毒病由林世堂等[10]學(xué)者首次報道，隨后國內(nèi)外學(xué)者對番鴨細(xì)小病毒的生物學(xué)特性及番鴨細(xì)小病毒病的診斷與防制進(jìn)行了研究[3,11,12]。Zadori等[13]首次報道了 MPV的全基因組序列，比較分析發(fā)現(xiàn)MPV和GPV的基因組有81.9%同源性。張云等[14]對1株鵝細(xì)小病毒EP22和2株番鴨細(xì)小病毒DV2、J3D6株的全長基因進(jìn)行測序分析，根據(jù)NS和VP1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明:番鴨和鵝細(xì)小病毒來自共同的祖先，但隨著宿主的不同而演化為不同的分支。MPV NS1基因編碼MPV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1蛋白，NS1蛋白是MPV基因組本身編碼的一種反式激活蛋白，對于其基因組的早期和晚期的轉(zhuǎn)錄都具有重要作用[15]。另外，NS1蛋白參與病毒DNA的復(fù)制及調(diào)節(jié)基因表達(dá)[4]。

本研究利用PCR擴增了MPV的NS1基因片段，經(jīng)過克隆和測序分析發(fā)現(xiàn)，MPV FS株 NS1基因核苷酸和氨基酸序列與國外的FM株的相似性高達(dá)99.3%和98.4%，表明NS1基因是高度保守的。為了分析原核表達(dá)的NS1蛋白的生物學(xué)特性，本實驗構(gòu)建了pET32a-NS1表達(dá)載體，并在大腸桿菌Rosetta中成功表達(dá)。本試驗選擇的Rosetta菌株，是攜帶氯霉素抗性質(zhì)粒 BL21的衍生菌，能補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA）對應(yīng)的tRNA，從而提高了NS1基因在pET32a (+)中的表達(dá)水平。對原核表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析結(jié)果表明，表達(dá)的NS1蛋白主要以包涵體的形式存在于菌體裂解后的沉淀中。本研究中NS1蛋白在大量表達(dá)后用Ni柱進(jìn)行純化，獲得的蛋白含有雜蛋白，經(jīng)過改變純化所用緩沖液的PH值，雜蛋白有所減少。今后仍需要對純化條件進(jìn)行優(yōu)化，來獲得高純度的蛋白，這為MPV的診斷、抗原性分析以及蛋白的功能研究提供了基礎(chǔ)。

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