童 武，張青占，鄭 浩，劉 飛，姜一峰，單同領(lǐng)，周艷君，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

偽狂犬病是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征的一種烈性傳染病[1]。豬是偽狂犬病毒的天然宿主、貯存者和傳播者[1,2]。此病對養(yǎng)豬業(yè)危害極大，常在豬群中爆發(fā)流行。該病毒可感染各個年齡段的豬，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、哺乳仔豬高死亡率及種豬不育。除了使新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀外，PRV還可以侵害免疫系統(tǒng)[3]，使其容易繼發(fā)其他疾病，如藍耳?。╬orcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）[4]。偽狂犬最早在美國發(fā)生，我國于上世紀40年代末在貓中首次發(fā)現(xiàn)了偽狂犬病毒，60年代初在豬群中也出現(xiàn)了該病毒流行。目前，偽狂犬病毒在我國廣泛流行，嚴重威脅著豬群的健康[5]，并造成了嚴重經(jīng)濟損失[6]。

偽狂犬病毒屬于皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科，能感染多種宿主。豬感染PRV后，有的呈隱性感染，但長期攜帶病毒；出現(xiàn)臨床癥狀的耐過豬也能成為病毒的攜帶者，成為傳染源，這增加了PRV防治的難度[7,8]。部分歐洲國家宣布通過接種基因缺失弱毒疫苗及相應(yīng)的血清學(xué)診斷技術(shù)的監(jiān)測根除了偽狂犬 (Decision 2011/648/EU, Annex I)，而由于野生動物的感染與攜帶，歐洲大陸國家仍難以實現(xiàn)PRV根除[9-11]。我國也廣泛使用PRV基因缺失弱毒疫苗來防控該病。但自2011年以來，許多使用gE基因缺失活疫苗免疫的規(guī)?；i場出現(xiàn)了母豬產(chǎn)弱仔、死胎、流產(chǎn)，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等疑似偽狂犬的臨床癥狀。本實驗室從江蘇某疑似偽狂犬的發(fā)病豬場進行了PRV流行毒株的檢測及分離鑒定，結(jié)果表明該豬場存在偽狂犬病毒野毒感染，且疫苗不能提供完全的保護。對該病毒的分離鑒定及生物特性分析，有利于進一步認清流行病毒的特征，為控制該病的傳播和蔓延以及進一步研制新型疫苗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料病料來源于江蘇省某發(fā)病豬場，該豬場接種PRV基因缺失弱毒疫苗，但出現(xiàn)疑似偽狂犬病癥狀。兩頭瀕臨死亡的7日齡新生仔豬，取其心、肝、脾、肺、腎、腦、腹股溝淋巴結(jié)、小腸及內(nèi)容物和血液等病料進行反復(fù)凍融研磨離心，將上清液分裝保存。

1.2 試劑 細胞 陽性血清及小鼠LATaqDNA聚合酶，dNTP mix，2×GC Buffer I，pMD18-T Vector，DL2000 DNA Marker等為寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)；DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS） 和 DMEM 培養(yǎng)基為 Invitrogen公司產(chǎn)品；Vero細胞由上海獸醫(yī)研究所豬病實驗室保存，以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)；PRV Barthak61疫苗株陽性豬血清、HeN1株陽性豬血清[12]及PRV經(jīng)典強毒S株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬病研究室饋贈；BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。

1.3 引物參照 GenBank 中 PRV Becker株的全基因組序列（GenBank:JF797219），設(shè)計了分別針對gB基因和gE基因的兩對引物:gB up/gB down和gE up/gE down，用于 PCR 檢測 PRV。同時，設(shè)計一對引物gEF/gER，用于擴增gE全長基因序列，以作進化分析。引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成，引物序列如表1。

表1 用于PRV病毒鑒定和gE基因擴增的引物Table 1 The primers for detecting PRV and amplifi cation of gE gene

1.4 病毒核酸的提取及PCR參照說明書，以QIAGEN組織／細胞基因組DNA提取試劑盒提取核酸。PCR 反應(yīng)體系:LATaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，2×GC Buffer Ⅰ 25 μL，dNTP mixture（各 2.5 mM）8 μL，上下游引物各 1 μL，模版DNA 2μL，補水至50 μL。反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性 5 min; 94℃ 1 min，退火 1 min，72℃延伸，35 個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。其中，檢測gE和gB退火溫度分別為64℃和68℃，延伸1 min；gE全基因擴增退火64℃，延伸2 min。用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測回收PCR 產(chǎn)物。

1.5 病毒的分離與純化將PCR檢測陽性病料組織研磨液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，取0.5 mL接種單層Vero細胞，37℃孵育1 h后棄接種液，加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察細胞病變。待70%左右的細胞發(fā)生病變時收毒，凍融后離心取上清，接種Vero細胞再傳2次。提取收獲液中的 DNA，以 gB up/ gB down 和 gE up/ gE down 兩對引物進行PCR檢測。

將收獲的病毒液以DMEM作1：10稀釋至10-6，稀釋病毒以1 mL接種60 mm培養(yǎng)平皿中的融合單層Vero細胞，37℃孵育1 h后棄接種液，并以DMEM洗2次，每平皿加入12 mL覆蓋培養(yǎng)層（含1%瓊脂糖和2% FBS）。37℃培養(yǎng)48 h后，挑起單個空斑于0.5 mL DMEM中?？瞻咭悍磸?fù)凍融3次，以DMEM稀釋并接種Vero細胞，作下一輪空斑純化。將經(jīng)過6輪空斑純化的空斑液接種T25培養(yǎng)瓶中的Vero細胞，擴大培養(yǎng)。收獲病毒液分裝于1.5 mL離心管，凍存于-75℃。

1.6 IFA鑒定將分離病毒接種6孔板中的Vero細胞，36 h后，棄培養(yǎng)液，以預(yù)冷的80%乙醇4℃固定1 h，分別加1：500稀釋的HeN1株陽性豬血清及1：200稀釋的Barthak61株陽性豬血清各1 mL，37℃孵育1 h，PBS洗滌后用FITC標記兔抗豬抗體37℃孵育1 h。用DAPI（0.2 μg/mL）對細胞核進行染色后置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 電鏡觀察將病毒液以 130 000×g超速離心 2 h，以STE緩沖液重懸沉淀，用2%磷鎢酸負染，在電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。

1.8 病毒滴度測定將病毒液稀釋成 10-1～10-10，分別接種到96孔培養(yǎng)板中長成融合單層的Vero上，每個稀釋度接種8孔，培養(yǎng)板最后兩列孔接種稀釋液作對照，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，96 h后觀察細胞病變，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50[12]。

1.9 動物試驗6周齡BALB/c小鼠70只，分為兩組。第一組 35只，分別接種含101.0～106.0TCID50的分離病毒稀釋液，每個稀釋度5只，每只腹股溝皮下注射0.1 mL。同時以5只小鼠注射DMEM培養(yǎng)液作為陰性對照。第二組35只小鼠，接種PRV S株，按照第一組方法進行。接種后每天觀察小鼠臨床癥狀及死亡情況，按照Reed和Muench法計算病毒的半數(shù)致死量（LD50）[13]。

1.10 病毒的遺傳變異性分析提取純化分離病毒的基因組DNA，以gEF/gER為引物，PCR擴增完整的gE基因編碼區(qū)。膠回收目的片段，連接pMD18-T載體后選擇陽性質(zhì)粒測序，并用生物學(xué)軟件進行進化分析。

2 結(jié)果

2.1 病料檢測對仔豬組織勻漿液進行反復(fù)凍融，提取總DNA，用gB和gE的特異性引物進行PCR檢測，結(jié)果如圖1所示。在檢測的8個組織中，僅腦組織樣品中能擴增出與陽性對照大小相一致片段，分別為633 bp和366 bp。這顯示，腦組織中可能存在PRV感染。由于該豬場使用的疫苗株缺失gE基因，gE基因陽性表明感染PRV為野毒株。

2.2 病毒的分離將PRV陽性病料組織研磨液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，接種至單層Vero細胞，36 h后觀察到了典型的細胞病變，細胞聚集、變圓、脫落，有的形成合胞體（圖2）。提取DNA做PCR檢測，gB up/ gB down 和 gE up/ gE down 兩對引物均能擴增出特異性目的片段（圖3，圖4），這表明從病料中分離出的PRV為野毒株，并命名為JS-2012株。

圖1 組織樣品偽狂犬病毒PCR檢測結(jié)果Fig.1 The results of PCR detecting samples for PRV

圖2 病料腦組織勻漿上清液感染Vero細胞引起的細胞病變Fig.2 Cytopathogenic effects of Vero cells inoculated with homogenated brain tissue supernatant

圖3 gB up/ down的PCR鑒定病毒結(jié)果Fig.3 PCR detecting the isolated virus with gB up/ down

圖4 gE up/ down的PCR鑒定病毒結(jié)果Fig.4 PCR detecting the isolated virus with gE up/ down

2.3 病毒的IFA鑒定分離病毒感染Vero后，用PRV Barthak61株和HeN1株陽性血清做IFA檢測。如圖5所示，病毒感染能產(chǎn)生典型合胞體病變，合胞體能與PRV陽性血清作用，顯示強烈熒光，這證實分離病毒確為PRV。兩種血清均能和分離病毒作用，顯示特異性熒光，但使用HeN1株陽性血清的熒光亮度強于Bartha k61毒株。

圖5 病毒的間接免疫熒光檢測結(jié)果Fig.5 IFA identifi cation of the isolated virus

2.4 病毒粒子形態(tài)將分離病毒超速離心并負染，在電鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)典型的偽狂犬病毒粒子形態(tài)（圖6）。病毒粒子呈球形，直徑在160 nm左右，有明顯的核芯和正二十面體的核衣殼結(jié)構(gòu)，囊膜表面有明顯的放射狀纖突。這進一步證實分離的病毒是偽狂犬病毒。

圖6 病毒粒子的電鏡觀察Fig.6 The morphology of virions

2.5病毒滴度將純化后的JS-2012株接種Vero細胞進行病毒擴增，以96孔板中的Vero細胞測定了病毒滴度。JS-2012株感染Vero細胞，病毒滴度可達107.43TCID50/ mL。

2.6小鼠感染試驗將PRV S株和分離株JS-2012接種BALB/c小鼠，分別在d 3和d 4出現(xiàn)典型的偽狂犬病癥狀；注射部位奇癢、不斷啃咬、導(dǎo)致皮膚出血、毛發(fā)蓬亂、脫落，并開始出現(xiàn)死亡。接種JS-2012 103.0～106.0TCID50的小鼠和 PRV S 104.0～106.0TCID50的都在接種后5 d內(nèi)出現(xiàn)死亡，其后不再發(fā)病與死亡。計算兩者對BALB/c小鼠的半數(shù)致死量（LD50），PRV JS-2012 株 為 102.37TCID50，PRV S 株 為 103.37TCID50。注射同等劑量DMEM培養(yǎng)液的對照小鼠沒有異常表現(xiàn)。結(jié)果表明，PRV JS-2012株的半數(shù)致死量要低于PRV S經(jīng)典強毒株。

2.7 病毒gE基因的擴增及其進化分析以gEF/gER為引物，擴增出了包含完整gE基因序列的約1700 bp片段（圖7）。測序并分析發(fā)現(xiàn)gE基因全長為1740 bp。利用生物學(xué)軟件DNAStar對JS-2012gE核苷酸序列與其他毒株序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同毒株之間同源性很高，但JS-2012和2012年新分離的毒株位于一個相對獨立的分支中，而與以前分離的毒株親緣關(guān)系相對較遠（圖8）。核酸序列比對發(fā)現(xiàn)，除Ea株外，JS-2012和其他毒株相比，存在2個位點上3個連續(xù)堿基的插入。與Ea株相比，JS-2012只在1個位置存在3個連續(xù)堿基的插入，導(dǎo)致在編碼的氨基酸序列上增加1個冬氨酸殘基，其他位置上存在不同程度的堿基替換。

圖7 gE全長基因的PCR擴增結(jié)果Fig.7 PCR products of gE gene

圖8 PRV gE基因的進化樹分析Fig.8 Phylogenetic analysis of PRV gE sequence

3 討論

本研究通過采集PRV弱毒疫苗免疫豬場疑似偽狂犬發(fā)病仔豬病料，將PCR檢測陽性病料接種細胞，并通過免疫熒光和電鏡形態(tài)觀察，證實從發(fā)病仔豬腦組織中分離出1株P(guān)RV野毒株，且該野毒株比PRV經(jīng)典株S株對小鼠的LD50低。對gE基因的進化分析發(fā)現(xiàn)，該野毒株與新近分離的毒株遺傳關(guān)系近，與以前分離的毒株遺傳關(guān)系較遠。

由于PRV基因缺失弱毒疫苗的推廣應(yīng)用，該病在我國豬場顯著降低，也有一些國家通過接種基因缺失弱毒疫苗及相應(yīng)的血清學(xué)診斷技術(shù)的監(jiān)測，實現(xiàn)了偽狂犬根除。然而，2011年開始，我國不同省份多個豬場出現(xiàn)接種PRV弱毒疫苗仍發(fā)生偽狂犬的現(xiàn)象。2012年下半年，江蘇省某豬場也發(fā)生接種基因缺失弱毒疫苗后仔豬出現(xiàn)疑似偽狂犬癥狀。我們采取了該豬場發(fā)病仔豬病料，對偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等常見病原進行了PCR檢測，結(jié)果僅偽狂犬病毒陽性。從病料中，我們也成功分離出1株P(guān)RV野毒株JS-2012。這顯示，該豬場存在PRV野毒感染而導(dǎo)致仔豬發(fā)病，而使用的疫苗不能提供有效保護。我們擴增了野毒株JS-2012的gE基因全序列，進化分析顯示，JS-2012株與新近分離株處于一個相對獨立的分支中，遺傳關(guān)系近，而與以前分離株遺傳關(guān)系遠。這表明，與以前分離株相比，當(dāng)前流行株發(fā)生一定程度變異。因此，豬場中變異株的出現(xiàn)，可能導(dǎo)致了疫苗免疫失敗的發(fā)生。我們測定了JS-2012株和PRV經(jīng)典毒株S株對BALB/c小鼠的LD50，結(jié)果顯示，接種后JS-2012株接種組小鼠比S株組發(fā)病時間和死亡時間要晚，但JS-2012株的LD50比S株的低。這表明JS-2012株與S株對小鼠的致病特征不同，單從致死率來看，JS-2012株比S株毒力強。是否因流行株變異導(dǎo)致毒力增強而突破現(xiàn)有疫苗的保護呢？這尚不能確定。如果流行株發(fā)生重要抗原變異，也可能導(dǎo)致疫苗免疫失敗。因此，還需要對流行株作更廣泛和深入的研究，尋找病毒基因組的變異區(qū)域，研究變異給病毒毒力和抗原帶來的影響，從而確定導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗免疫失敗的原因，為豬場防控PRV提供理論和技術(shù)支持。

[1]殷震, 劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京： 科學(xué)出版社,1997： 700-713.

[2]斯特勞B E, 阿萊爾S D, 蒙加林W L, 等.豬病學(xué)[M].8版.北京： 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2000： 195-196.

[3]馮敏燕.偽狂犬病防制的最新進展[J].國外獸醫(yī)學(xué)-畜禽傳染病 , 1990, (1)： 7-8.

[4]Lglesias G, Trujano M, Lokensgard J,et al.Study of the potential involvement of pseudorabies virus inswine respiratory disease[J].Can J Vet Res, 1992, 56(1)： 74-77.

[5]鄧仕偉, 汪勇, 薛春芳.我國偽狂犬病流行現(xiàn)狀及新特點[J].動物醫(yī)學(xué)進展, 2006, 27(9)： 105-107.

[6]Tamba M, Calabrese R, Finelli E,et al.Risk factors for Aujeszky's-disease seropositivity of swine herds of a region of northern Italy[J].Prev Vet Med, 2002, 54(3)：203-212.

[7]Pomeranz L E, Reynolds A E, Hengartner C J.Molecular biology of pseudorabies virus： impact on neurovirology and veterinary medicine[J].Microbiol Mol Biol Rev,2005, 69： 462-500.

[8]Schoenbaum M A, Beran G W, Murphy D P.Pseudorabies virus latency and reactivation in vaccinated swine[J].Am J Vet Res, 1990, 51(3)： 334-338.

[9]Pannwitz G, Freuling C, Denzin N,et al.A longterm serological survey on Aujeszky's disease virus infections in wild boar in East Germany[J].Epidemiol Infect, 2012,140(2)： 348-358.

[10]Vengust G, Valencak Z, Bidovec A.Presence of antibodies against Aujeszky's disease virus in wild boar(Sus scrofa) in Slovenia[J].J Wildl Dis, 2005, 41(4)：800-802.

[11]Sedlak K, Bartova E, Machova J.Antibodies to selected viral disease agents in wild boar from the Czech Republic[J].J Wildl Dis, 2008, 44(3)： 777-780.

[12]彭金美, 安同慶, 趙鴻遠, 等.豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2013, 35(1)： 1-4.

[13]Reed L J, Muench H.A simple method of estimating fifty percent endpoints[J].Am J Hyg, 1938, 27(3)： 493-497.