張國(guó)付，蔣素華，崔 波，，袁秀云，田云芳，葉永忠

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.鄭州師范學(xué)院生物工程研究所，河南 鄭州 450044)

3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是糖酵解途徑中的一種關(guān)鍵酶，催化3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)變?yōu)閘，3-二磷酸甘油醛，同時(shí)以NAD+為受氫體生成NADH.GAPDH 高度保守，一直以來(lái)被認(rèn)為是僅存于細(xì)胞質(zhì)中的管家基因產(chǎn)物，在同種細(xì)胞或組織中表達(dá)量恒定，故被廣泛用作細(xì)胞質(zhì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參.GAPDH 在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞膜上均有定位，其表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平受到調(diào)節(jié)，mRNA 水平和蛋白水平會(huì)隨著各種刺激而變化［1］.人們?cè)诶冒攵縍T-PCR 方法研究基因表達(dá)時(shí)，需引入一些參照基因，以此來(lái)控制試驗(yàn)誤差并對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理［2-4］.而在植物研究領(lǐng)域常用的內(nèi)參照基因有β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、3-磷酸甘油醛脫氫酶，18S rRNA，G3PDH(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase，3-磷酸甘油脫氫酶)等［5，6］.其中GAPDH基因因具有高度的保守性，通過(guò)比較不同物種GAPDH基因核苷酸或氨基酸序列的異同，可對(duì)物種進(jìn)行分類和建立各物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系［7，8］.迄今為止，眾多研究表明已從許多高等植物如小麥［9］、水稻［10］、谷子［11］、擎天鳳梨［12］、三七［5］等克隆到了GAPDH基因，但有關(guān)文心蘭GAPDH基因的克隆和研究還未見(jiàn)報(bào)道.文心蘭系蘭科(Orchidaceae)文心蘭屬(Oncidium Swartz)蘭花的總稱，屬?gòu)?fù)莖類洋蘭，附生或地生，原產(chǎn)墨西哥、西印度群島、巴西等地，近年來(lái)中國(guó)華南、華東地區(qū)已廣泛引種栽培.本研究以文心蘭的花期花葶為試驗(yàn)材料，用RT-PCR 方法克隆了GAPDH基因的部分cDNA 序列，以此基因作為內(nèi)參基因，為研究其生理功能及其他基因在文心蘭中的表達(dá)和調(diào)控奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

文心蘭來(lái)自鄭州師范學(xué)院智能溫室.取文心蘭花期的花葶在液氮中速凍后，存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?限制性內(nèi)切酶、TaqDNA 聚合酶、T4-DNA連接酶、DNA Marker 等工具酶均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;新型植物RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，普通瓊脂糖DNA 回收試劑盒、IPTG，X-Gal，dNTP為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品.其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.所用質(zhì)粒pMD19-T和大腸桿菌DH5α 均購(gòu)自TaKaRa 公司.

1.2 文心蘭GAPDH基因的克隆

1.2.1 文心蘭花葶總RNA的提取 將文心蘭花期花葶在液氮中研磨至粉狀，用Trizol(Invitroigen公司)試劑提取其總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性.

1.2.3 cDNA 單鏈合成 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照Ferrnentas RevertAidTM First strand cDNA synthesis Kit使用說(shuō)明，用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa 公司)合成的第1 鏈cDNA 于-20℃保存.

1.2.4 引物合成與RT-PCR 擴(kuò)增 通過(guò)對(duì)NM_101214.3(擬南芥)、NM_001084061.1(擬南芥)、EF408234.1(甜菜)、DQ355800.1(大豆)、L07500.1(豌豆)、GQ848032.1(水稻)等植物GAPDH基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，找出高度保守的區(qū)段，利用Primer 5.0和DNAMAN 生物軟件設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物Sense primer:5′-AA(G/A)ATCG-GAATCAA(T/C)GG(G/A)TTCG-3′和Antisense primer:5′-TC(A/T)G(C/A)(C/T)TCCTCCTTGAT(T/G)GC-3′，引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成.

以文心蘭cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增.反應(yīng)體系:10×PCR buffer 2.0μL，dNTP(2.5μmol·L-1)2.0μL，F(xiàn)，R(10μmol·L-1)各0.4μL，Taq DNA 酶(10 U·μL-1)0.2μL，模板DNA0.5μL，定量補(bǔ)足ddH2O 至20μL.反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，58℃復(fù)性40 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min.PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶，按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行回收，最終得到30μL的產(chǎn)物.

1.2.5 構(gòu)建重組質(zhì)粒 取4μL 回收產(chǎn)物連接到pMD19-T vector，構(gòu)建重組質(zhì)粒，操作方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有50 mg·L-1氨芐青霉素，IPTG和X-Gal的LB 固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h，藍(lán)白斑篩選重組子.

1.2.6 重組質(zhì)粒的鑒定和測(cè)序分析 陽(yáng)性克隆通過(guò)搖菌擴(kuò)增，按照質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，并對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR 鑒定，最后將陽(yáng)性質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序.測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNAMAN和Primer5.0 生物軟件進(jìn)行序列多重比較和翻譯，同源性在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)網(wǎng)站上進(jìn)行Blast 搜索.

2 結(jié)果與分析

2.1 文心蘭花葶總RNA的質(zhì)量分析

由圖1可見(jiàn)，所提取文心蘭總RNA的28S和18S 條帶完整清晰，且28S的亮度是18S的2倍左右，表明所提取總RNA 完整性較好，沒(méi)有降解.紫外分光光度法測(cè)得OD260/OD280的比值介于1.8～2.0，表明總RNA的純度較高，沒(méi)有糖、蛋白質(zhì)等污染.

圖1 文心蘭花葶總RNA的提取Fig.1 Extraction of total RNA

2.2 文心蘭花葶GAPDH基因的擴(kuò)增

用材料與方法中所設(shè)計(jì)的引物，以文心蘭花葶的cDNA為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到了880 bp 左右的片段(圖2)，這個(gè)片段與預(yù)期長(zhǎng)度基本相同，并對(duì)此擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收.

圖2 文心蘭花葶目的基因的擴(kuò)增Fig.2 Amplification of target gene

2.3 GAPDH基因cDNA 克隆

對(duì)上述回收的產(chǎn)物連接到pMD19-T，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行菌落培養(yǎng)，挑取白斑進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增，并電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)得到的片段與上述以cDNA為模板得到的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度相同，對(duì)經(jīng)檢測(cè)無(wú)誤的2個(gè)白斑菌進(jìn)行搖菌提取質(zhì)粒后，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR 檢測(cè)，各有1 條約880 bp 左右的條帶，證明PCR 擴(kuò)增的片段已克隆到pMD19-T載體上.

2.4 GAPDH基因cDNA 序列測(cè)定和分析

測(cè)序結(jié)果表明，所獲得的2 條GAPDH基因cDNA片段的長(zhǎng)度均為875 bp，編碼291個(gè)氨基酸殘基，與預(yù)計(jì)結(jié)果相符，同源性比較結(jié)果顯示，該片段的核苷酸序列與其他植物GAPDH基因的核苷酸序列的同源性均在79%～92%之間，其中同源性最高的是蕙蘭(JN177724.1)92%，與蝴蝶蘭的同源性為89%(圖3)，所克隆的2個(gè)GAPDH基因cDNA片段氨基酸序列同源性與其他植物氨基酸序列的同源性也均在85%以上，反映出該基因在進(jìn)化上較為保守，表明已克隆出GAPDH基因的部分cDNA 序列.將這2個(gè)GAPDH基因的cDNA片段分別命名為OnGA1和OnGA2，并在GenBank 注冊(cè)，登錄號(hào)分別為JN981141和JN981142.同時(shí)在GenBank中未查詢到文心蘭的GAPDH基因.

圖3 文心蘭GAPDH基因序列比對(duì)分析Fig.3 Multiple sequence alignment of GAPDH gene in Oncidium

采用DNAMAN 生物分析軟件，對(duì)文心蘭GAPDH基因及玉米DQ245685.1、甘蔗EF189713.1、狼尾 草GQ398107.1、水 稻GQ848032.1、鳳 梨HM768296.1、三葉草JF968420.1、胡蘿卜JN086968.1、蕙蘭 JN177724.1、蝴 蝶 蘭 JN185660.1、大 麥M36650.1、擬南芥NM _101214.3、大豆NM _001253117.1、芥 菜 X04301.1、苜 蓿 XM _003601780.1 等植物GAPDH基因核苷酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并將比對(duì)結(jié)果用DNAMAN 軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)(圖4).結(jié)果表明，所克隆到的2個(gè)GAPDH基因與蕙蘭(JN177724.1)同源性最高，它們來(lái)自同一個(gè)進(jìn)化分枝;其次是蝴蝶蘭(JN185660.1)，而與胡蘿卜(JN086968.1)的同源性最低.從圖4 還可以看出，同源性高的均為單子葉植物，同源性低的均為雙子葉植物.

圖4 GAPDH 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of GAPDH

3 結(jié)語(yǔ)

本研究報(bào)道了來(lái)自于文心蘭GAPDH基因的2個(gè)cDNA 序列片段，片段長(zhǎng)度均為875 bp，編碼291個(gè)氨基酸殘基，其核苷酸序列和氨基酸序列與其他植物的GAPDH 具有廣泛的同源性，其中與蕙蘭(JN177724.1)和蝴蝶蘭(JN185660.1)的相似性最高，表明本試驗(yàn)克隆出的基因片段為文心蘭GAPDH基因，且具有高度的保守性，說(shuō)明其功能的重要性，并在 GenBank 登錄，登錄號(hào)分別為JN981141和JN981142，為進(jìn)一步研究其生理功能及其他基因在文心蘭中的表達(dá)和調(diào)控奠定了基礎(chǔ).

通過(guò)采用NCBI的Blast 工具對(duì)文心蘭GAPDH基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，不論是雙子葉植物還是單子葉植物，GAPDH的核苷酸和氨基酸序列都有較高的同源性，這一高度保守性與其在植物糖酵解途徑中功能的高度保守密切相關(guān).這使得GAPDH基因在生物體的不同組織細(xì)胞中或同一組織細(xì)胞的不同生理狀態(tài)下表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定.本研究結(jié)果表明，文心蘭的GAPDH基因在花期花葶中高度表達(dá)，為進(jìn)一步研究其生理功能和其它基因提供信息基礎(chǔ).

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