張建宏，張淑平，陳 文，康相濤，黃艷群

(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002)

微衛(wèi)星標記由于為多等位基因標記，在基因定位、遺傳多樣性研究上具有重要的應用價值，開發(fā)新的雞微衛(wèi)星標記可進一步豐富雞微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫.位于啟動子區(qū)域的微衛(wèi)星具有潛在重要的功能［1，2］.雞Lpin1基因是雞重要的脂肪沉積相關的候選基因，雞Lpin1基因微衛(wèi)星的分布特性及其5′側(cè)翼區(qū)微衛(wèi)星變異的遺傳變異研究，可為進一步開展雞Lpin1基因的表達調(diào)控研究打下基礎.微衛(wèi)星DNA 又稱短串聯(lián)重復序列(Short tandem repeat，STR)，是基因組中廣泛存在的一種以1～6個核苷酸為重復單位串聯(lián)組成的核苷酸序列［3］.STR 標記能揭示比RFLP 高得多的多態(tài)性，曾被作為第2代分子標記廣泛應用于遺傳變異分析、物種起源進化、基因定位、指紋鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、法醫(yī)科學和動植物遺傳育種等領域.因為STR 標記必須依賴每類微衛(wèi)星兩端序列設計引物，這造成微衛(wèi)星標記的應用與開發(fā)的數(shù)量受到了一定的限制［4］.微衛(wèi)星的功能目前尚不甚明了，曾一度被認為呈選擇中性、缺乏功能性，但最近的報道顯示，微衛(wèi)星重復序列長度的變異能誘使啟動子構(gòu)象的變異，影響其結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的能力［2］.對基因非翻譯區(qū)的微衛(wèi)星變異研究顯示其參與基因的表達與調(diào)控［5］;重復序列的動態(tài)突變可引起mRNA和蛋白質(zhì)水平的變化［6］;還有研究顯示，微衛(wèi)星參與細胞分化過程，有自身特異性結(jié)合蛋白，還能直接編碼蛋白質(zhì)，是一種非?；钴S的堿基序列［5］.Lpin1基因是2001年發(fā)現(xiàn)的與機體脂肪沉積有密切相關性的基因，為Lpin 蛋白家族成員［7］，是一種Mg2+依賴性磷脂酸磷酸化酶基因，具有磷脂酸磷酸化酶的活性［8，9］，與動物脂肪形成密切相關［10］.在小鼠、人類Lpin1基因上的研究表明，該基因存在多種可變剪接產(chǎn)物，Lpin1-α 與 Lpin1-β 剪 接 體 在 人(NM _145693)［11］和鼠(NM_172950)［12］具有不同但互補的功能［13］.Lpin1的表達調(diào)控受多種因素的影響，磷酸化可改變基因的亞細胞定位，進而影響Lpin1的活性并最終導致其表達變化［14］.雞Lpin1基因的編碼序列(HM473175)包含19個外顯子，王伯君等［15］發(fā)現(xiàn)雞Lpin1基因編碼區(qū)的變異與皮下脂肪厚、腹脂重呈現(xiàn)顯著的關聯(lián).李素雅等［16］進行了雞Lpin1基因3′ UTR的變異研究.目前尚未見對雞Lpin1基因微衛(wèi)星序列分布及變異的報道.本研究進行了雞Lpin1基因組內(nèi)微衛(wèi)星分布特性、5′側(cè)翼區(qū)的微衛(wèi)星遺傳變異鑒定及其潛在效應研究，該研究可豐富雞的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫，為進一步進行該微衛(wèi)星變異的功能鑒定奠定基礎，同時也為Lpin1基因的表達調(diào)控機制及功能研究提供一定的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 血樣及其DNA 提取

河南家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程中心的固始雞(GS)、絲羽烏骨雞(SK)、河南斗雞(HG)、盧氏綠殼蛋雞(LS)、白來航(WL)、白洛克(WP)，每品種10 只，共計60份具有特色雞種的血樣.取80μL全血于1.5 mL Eppendorf 管中，加入500μL TE 緩沖液，8μL 25% SDS和9μL 蛋白酶K (10 g·L-1)，混勻置55℃水浴過夜.采用常規(guī)的酚氯仿抽提方法提取基因組DNA.抽提產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后-20℃保存?zhèn)溆?

1.2 微衛(wèi)星搜索和PCR 引物設計

采用SSR hunter 在雞Lpin1基因組(NC_006090)序列搜索潛在的微衛(wèi)星.根據(jù)雞Lpin1基因組(NC_006090)序列，使用Oligo 軟件設計1 對引物(MS)擴增位于雞 Lpin1 編碼序列(HM473175)的5′ 側(cè)翼區(qū)(Flanking region，F(xiàn)LR)預測的啟動子區(qū)域微衛(wèi)星序列，引物序列為:F:5′-AGCGGTCTCTCTTTGGTGAT-3′，R:5′-AGTAGTTGCTGCCTGAGACA-3′.預期PCR 擴增產(chǎn)物長度為180 bp 左右.引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成.

1.3 PCR 擴增及基因分型

PCR 反應體系:DNA 模板0.5μL，上游引物0.25μL，下游引物0.25μL，Taq 酶0.1μL，2×Reaction Mix 6.25μL，雙蒸水5.15μL，總反應體積12.5μL.PCR 反應程序:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火35 s ，72℃延伸35 s，72℃延伸10 min，30個循環(huán)，4℃終止反應.

PCR 擴增產(chǎn)物首先經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳進行初步檢測.然后取2μL 非變性PCR 產(chǎn)物在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳2 h(130 V 電壓)，采用改良的銀染技術(shù)顯色、分型，并用UVP 自動凝膠成像系統(tǒng)掃描保存圖像.

1.4 克隆測序

分別選取包含不同等位基因型的個體進行50μL 體系PCR 擴增，采用PCR 回收試劑盒進行產(chǎn)物純化(Tiangen).PCR 產(chǎn)物連接到pGM-T 載體(Promega)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐和X-gal的LB 固體培養(yǎng)基表面，挑取白斑進行搖菌，12～16 h后進行菌液PCR 擴增做進一步鑒定.經(jīng)PCR 鑒定為陽性克隆的菌液送上海生物工程有限公司測序.對于包含不同等位基因的雜合型個體通過從同一個體選擇多個克隆進行測序，以保證獲得2 條鏈的序列信息.

1.5 基因分析預測

采用FirstEF 軟件進行Lpin1基因啟動子和第1 外顯子預測，采用SSR hunter 軟件進行微衛(wèi)星搜索，采用TFSEARCH 軟件進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測.

1.6 統(tǒng)計分析

采用BandScan 軟件進行非變性聚丙烯酰胺凝膠的基因型判別，采用Cervus2.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，具體指標包括等位基因數(shù)、等位基因頻率、雜合度及多態(tài)信息含量(PIC)等參數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 雞Lpin1基因的啟動子預測

將雞Lpin1基因的基因組序列(NC_006090)與其編碼序列(HM473175)進行比對分析表明，雞Lpin1基因的第1 編碼外顯子位于基因組序列(NC_006090)的20629～20822 區(qū)域.采用FirstEF 軟件(http://rulai.cshl.org/cgi-bin/tools/FirstEF/)［17］從雞基因組序列(NC_006090)的正義鏈預測到雞Lpin1基因的啟動子區(qū)域(12875～13444)，1個CpG window 位于13113～13314.CpGPlot 程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html)也預測到1個723 bp的CpG 島(12631～13353).

2.2 雞Lpin1基因微衛(wèi)星位點的搜索與分析

雞Lpin1基因組(NC_006090)序列約為50 kb，SSR hunter 軟件從中搜索到9個STR(表1)，其頻率為每5.5kb 有1個STR.這些序列多為二核苷酸型串聯(lián)重復序列，僅包含1個三核苷酸型和1個復合型(四核苷酸與二核苷酸復合型)STR，其重復次數(shù)在5～18 間.其中3個STR 位于雞Lpin1基因(HM473175)的5′ FLR，6個位于內(nèi)含子區(qū)域.復合微衛(wèi)星(命名為CLP532)的核心序列正好位于預測的啟動子區(qū)域附近，CLP532 微衛(wèi)星的核心序列在雞基因組(NC_006090)參考序列為(TATT)6/(TG)16(圖1).

圖1 位于預測的雞Lpin1基因啟動子區(qū)域附近的復合微衛(wèi)星序列Fig.1 The composite microsatellite located at the predicted promoter region of chicken Lpin1 genomic sequence

表1 從雞Lpin1基因組序列(NC_006090)搜索到的STRsTable 1 STRs searched from the chicken Lpin1 genome sequence (NC_006090)

2.3 CLP532 復合微衛(wèi)星變異的鑒定

采用MS 引物從6個不同品種雞的基因組中擴增CLP532 復合微衛(wèi)星核心序列，其擴增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)，表明MS 引物對該微衛(wèi)星的PCR 擴增特異性好、擴增效率高，獲得了預期的180 bp 左右的條帶.從瓊脂糖凝膠電泳圖上可以清楚地看出，PCR 擴增產(chǎn)物在所檢測個體間存在多種長度差異，顯示該微衛(wèi)星在群體中存在豐富的變異.

由于受檢測靈敏度限制，對于一些長度差異在20個堿基內(nèi)的等位基因，采用瓊脂糖凝膠電泳常常無法有效分離，從而影響基因型判別的準確性.因此本試驗進一步采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測CLP532 微衛(wèi)星的變異.采用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，PCR 擴增產(chǎn)物均得到了有效分離，在固始雞(GS)、絲羽烏骨雞(SK)、河南斗雞(HG)、盧氏綠殼蛋雞(LS)、白來航(WL)、白洛克(WP)6個品種中檢測共得到A，B，C，D，E，F(xiàn) 6種等位基因型(圖3).式為:(TATT )5/(TG )7，(TATT )5/(TG )8，(TATT)4/(TG)13，(TATT)4/(TG)15，(TATT)5/(TG)18和 (TATT)5/(TG)19.MS 引 物 擴 增的CLP532 微衛(wèi)星序列長度在158～182 bp 間，其等位基因的序列長度變異在25 bp 左右.該復合微衛(wèi)星的核心序列TTAT和TG的重復數(shù)同時都發(fā)生了變異，且發(fā)現(xiàn)TG 核心序列的變異類型相對比TATT 多.

圖2 MS 引物部分擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.2 The agarose gel electrophoresis photo of the part of PCR amplification products by MS primer set

選擇包含不同等位基因的代表性個體進行克隆測序，成功獲得了A，B，C，D，E，F(xiàn) 6種等位基因的序列信息(圖4，表2).其核心序列的具體變異形

圖3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Fig.3 The map of MS primer amplification products by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis

圖4 CLP532 微衛(wèi)星不同等位基因的克隆測序峰Fig.4 The clone sequencing peak map of different alleles of CLP532 microsatellite

表2 CLP532 微衛(wèi)星等位基因核心序列及其PCR 擴增長度Table 2 The core sequence of different alleles for CLP532 microsatellite and the PCR amplification length

2.4 CLP532 微衛(wèi)星在品種間的遺傳多態(tài)性

CLP532 微衛(wèi)星在品種間的變異統(tǒng)計結(jié)果表明(表3)，從6個雞品種中共檢測到6種等位基因.B，C，D 等位基因廣泛存在于所檢測的6個品種中，A 等位基因存在于4個品種中，E 等位基因存在于3個品種中，而F 等位基因僅存在于固始雞和盧氏綠殼蛋雞中，未檢測到品種特異性的等位基因.從固始雞、河南斗雞和盧氏綠殼蛋雞檢測到了5種等位基因，從白來航、白洛克和絲羽烏骨雞檢測到4種等位基因.6個品種雞的平均等位基因數(shù)為4.5，平均多態(tài)信息含量為0.665，平均雜合度為0.763，其中絲羽烏骨雞平均雜合度最高，而白洛克表現(xiàn)了最低的平均雜合度.

2.5 CLP532 微衛(wèi)星變異對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的影響預測

采用在線分析軟件TFSEARCH 進行CLP532微衛(wèi)星G 等位基因核心序列(來自于基因組序列NC_006090)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測(圖5)，在CLP532 微衛(wèi)星核心序列區(qū)域共預測到23個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，包括13個CdxA，3個HNF-3b，3個HNF-2，3個Pbx-1和1個XFD-1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點.分別進行CLP532 微衛(wèi)星不同等位基因核心序列的轉(zhuǎn)錄因子預測表明，該微衛(wèi)星核心序列長度的變異引起了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的改變.E，F(xiàn) 等位基因與G 等位基因相比少了6個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，分別為3個CdxA，1個HNF-3b，1個HNF-2和1個Pbx-1.C，D 等位基因與G 等位基因相比則少了12個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，分別為6個CdxA，2個HNF-3b，2個HNF-2和2個Pbx-1.

表3 CLP532 微衛(wèi)星在品種間的多態(tài)性Table 3 CLP532 microsatellite Polymorphisms among breeds

圖5 CLP532 微衛(wèi)星G 等位基因核心序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測Fig.5 Transcription factor binding site prediction of CLP532 microsatellite core sequence for G allele

3 小結(jié)與討論

3.1 新的微衛(wèi)星序列的開發(fā)

微衛(wèi)星廣泛分布于真核生物的基因組中，有報道顯示，除著絲粒及端粒外染色體的其它區(qū)域廣泛分布有微衛(wèi)星位點［18］.在哺乳動物中似乎每個基因都至少存在1個微衛(wèi)星標記［19］，PRIMMER等［20］報道在禽類基因組中微衛(wèi)星分布的密度相對較低，大約為20～39 kb 1個STR，并認為這可能是家禽基因組中所含的非編碼DNA相對少于哺乳動物所致.本研究顯示，雞Lpin1基因組上存在高頻率的微衛(wèi)星序列(平均每5.5 kb 則分布1個STR).目前主要應用的6種微衛(wèi)星開發(fā)技術(shù)包括直接文庫篩選法、基于錨定PCR 技術(shù)法、單引物延伸富集法、選擇雜交富集法、生物信息學法、轉(zhuǎn)移擴增法.但是利用生物信息學方法開發(fā)微衛(wèi)星只能應用于序列信息已知的物種［21］.然而，隨著基因組序列、mRNA 序列等核酸序列的不斷增加，生物信息學法已會發(fā)展成為一種簡便、快速、實用的微衛(wèi)星開發(fā)技術(shù).本研究采用生物信息學方法從雞Lpin1基因組(NC_006090)序列發(fā)現(xiàn)了豐富的串聯(lián)重復序列，采用瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和克隆測序的方法從6個雞品種中鑒定了1個位于雞Lpin1基因5′側(cè)翼區(qū)(預測啟動子區(qū)域)的微衛(wèi)星序列多態(tài)性，豐富了雞微衛(wèi)星標記數(shù)據(jù)庫.

3.2 CLP532 微衛(wèi)星在雞品種間的遺傳多樣性

本研究采用新鑒定的CLP532 微衛(wèi)星標記初步分析了該微衛(wèi)星在6個雞種的遺傳多樣性.從有限樣本數(shù)的6個雞品種中鑒定了6種等位基因，從固始雞、河南斗雞和盧氏綠殼蛋雞檢測到了5種等位基因，白來航、白洛克和絲羽烏骨雞檢測到4種等位基因.李素雅等［16］采用直接PCR 測序的方法從470 bp的3′-UTR 檢測到8個變異，采用與本試驗相同的樣本，從固始雞和盧氏綠殼蛋雞檢測到7個變異位點，而從10 只河南斗雞中未檢測到任何變異，顯示了河南斗雞在該區(qū)域的高度保守性.河南斗 雞 在 雞Lpin1基 因3′-UTR和5′ 側(cè) 翼 區(qū)CLP532 微衛(wèi)星標記變異的高度差異，顯示了河南斗雞在雞Lpin1基因不同區(qū)域選擇強度上的差異，這些差異是否與基因的表達調(diào)控乃至河南斗雞表現(xiàn)型有關聯(lián)尚需要進一步研究.

3.3 Lpin1基因5′ 側(cè)翼區(qū)微衛(wèi)星潛在功能分析

微衛(wèi)星快速進化而且存在于真核生物基因組的各個地方，但優(yōu)勢存在于非編碼DNA 區(qū)域［22］.本研究從雞Lpin1基因的基因組中搜索到9個微衛(wèi)星序列，3個位于基因的5′ 側(cè)翼區(qū)，6個位于內(nèi)含子區(qū)域，微衛(wèi)星在真核生物的豐度和位置及其高的突變率提示其在基因調(diào)控上的潛在和廣泛的作用.啟動子存在于結(jié)構(gòu)基因上游，是與基因轉(zhuǎn)錄啟動有關的一段特殊DNA 序列，控制基因表達(轉(zhuǎn)錄)的起始時間和表達的程度.啟動子區(qū)域的變異常會影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合從而影響基因的表達調(diào)控.很多的報道證實了位于啟動子區(qū)域的長度變異的STR 被克隆入載體能表現(xiàn)不同的表達能力［1，2，23］，SHIMAJIRI 等［1］研究表明matrix metalloproteinase 9基因的表達被短的STR 序列下調(diào)，TAE等［23］報道1個雙核苷酸重復序列在acetyl-CoA carboxylase基因的負調(diào)控效應是CAAT box 依賴性的，可被CAAT 增強子結(jié)合蛋白而逆轉(zhuǎn).非編碼區(qū)的微衛(wèi)星序列對于基因表達調(diào)控具有一定的作用，主要是由于形成了特異DNA，如Z-DNA［24］，HDNA［25］.Z-DNA 在特定的染色體區(qū)域上執(zhí)行著重要的功能，如結(jié)構(gòu)基因的啟動子和重組熱點均富含Z-DNA 結(jié)構(gòu)［26］.本研究預測雞Lpin1基因5′側(cè)翼區(qū)的STR 不同等位基因型可引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的變化，顯示該基因可能會通過該微衛(wèi)星序列長度變異程度進行基因的表達調(diào)控.

雞Lpin1基因組內(nèi)存在豐富的串聯(lián)重復序列，從位于雞Lpin1基因5′側(cè)翼區(qū)(預測的啟動子區(qū)域)的復合微衛(wèi)星CLP532中鑒定了7個等位基因，其長度差異在25 bp，顯示該微衛(wèi)星可作為新的微衛(wèi)星標記進行遺傳多樣性等研究.軟件預測該微衛(wèi)星長度的變異可引起CdxA，HNF-3b，HNF-2和Pbx-1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點及其結(jié)合位點數(shù)目的改變，顯示了該微衛(wèi)星長度的變異對Lpin1基因表達調(diào)控的潛在效應.

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