洪 軍，胡建業(yè)，牛亞菲，姬曉娜，趙安芳，王奕霞，黃瓊琳，李光耀

(河南城建學(xué)院生物工程系，河南 平頂山 467036)

抗生素藥物的濫用，導(dǎo)致了許多細(xì)菌、尤其是致病菌的抗藥性問(wèn)題.耐藥性超強(qiáng)的“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)更加重了人們對(duì)抗生素使用的擔(dān)心，細(xì)菌的抗藥性已成為困擾21 世紀(jì)人類(lèi)醫(yī)學(xué)、養(yǎng)殖業(yè)等發(fā)展的世界性難題，迫切需要產(chǎn)生一種新的抗菌藥物來(lái)替代抗生素.而抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物體抵御外源性病原微生物的入侵而產(chǎn)生的一類(lèi)小分子多肽，因其抗菌譜廣且不易使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，因而有望成為新一代抗菌藥物［1，2］.目前，它已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物、藥物開(kāi)發(fā)、臨床治療、食品防腐劑和飼料添加劑等，顯示出良好的應(yīng)用與發(fā)展前景.鱟素(TachyplesinI)是1988年由NAKAMURA 等人從中國(guó)鱟血細(xì)胞的酸性提取物中分離出來(lái)的一種具有典型環(huán)狀β-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽(AMPs)，它由17個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成.研究發(fā)現(xiàn)，鱟素具有廣譜抗菌活性，可抑殺細(xì)菌、真菌、病毒和原蟲(chóng)，還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的作用［3～8］.因其潛在作用和較小的相對(duì)分子質(zhì)量，在醫(yī)藥、畜牧和食品等領(lǐng)域有望成為新一代的抗生素替代品［9～11］.在作者前期的研究中采用2種短期誘導(dǎo)方法，研究鱟素能否誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，結(jié)果表明，鱟素對(duì)大腸桿菌ATCC25922、致病性大腸桿菌F41和金黃色葡萄球菌ATCC25923 均未誘導(dǎo)出抗藥性［12］.紫外線(xiàn)、亞硝基胍、離子束輻射等理化因素均是微生物中常用的誘變劑，經(jīng)這些誘變劑處理的細(xì)菌能引起基因突變，更易導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生.當(dāng)紫外線(xiàn)直接照射細(xì)菌時(shí)，輻射引起正常DNA分子相鄰胸腺嘧啶分子彼此結(jié)合形成二聚體，從而可能獲得變異的抗藥菌株.關(guān)于誘變細(xì)菌對(duì)鱟素耐受性的研究目前尚屬空白.本研究以大腸桿菌JM109和ATCC25922為研究對(duì)象，通過(guò)紫外線(xiàn)誘變技術(shù)對(duì)原始菌株進(jìn)行誘變，以相應(yīng)的未誘變菌株作對(duì)照，并通過(guò)鱟素濃度梯度平板對(duì)大腸桿菌進(jìn)行初篩.一方面對(duì)初篩到的抗鱟素菌株進(jìn)行亞抑菌濃度鱟素的連續(xù)傳代誘導(dǎo)，觀(guān)察紫外線(xiàn)對(duì)大腸桿菌的生物學(xué)效應(yīng)及其鱟素對(duì)紫外線(xiàn)誘變的細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的難易程度;另一方面，通過(guò)抗生素對(duì)初篩到的抗鱟素菌株進(jìn)行敏感性測(cè)定，觀(guān)察抗生素與鱟素是否有交互抗性.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 供試菌株:大腸桿菌ATCC25922 由廣東省微生物保藏中心提供，大腸桿菌JM109 由河南城建學(xué)院生物工程系保存.抗菌劑:鱟素由吉爾化(上海)有限公司合成，純度為95%以上，合成的鱟素含有2個(gè)二硫鍵，分別位于Cys-3和Cys-16 及Cys-7和Cys-12 之間;鹽酸左氧氟沙星和氨芐青霉素，分別由康普藥業(yè)股份有限公司和江西東風(fēng)藥業(yè)股份有限公司提供.

培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)瓊脂、酵母膏、胰蛋白胨由北京奧博星生物技術(shù)有限公司提供;瓊脂糖由上海艾研生物科技有限公司提供;氯化鈉由洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠(chǎng)提供;MH 肉湯由杭州天和微生物試劑有限公司提供.

1.1.2 主要儀器設(shè)備 HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)，LRH-250F型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，DG5033A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司).

1.2 藥敏試驗(yàn)

從斜面保存的菌種上挑取一環(huán)細(xì)菌，接種于滅菌三角瓶中的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37℃250 r·min-1恒溫?fù)u床上過(guò)夜培養(yǎng).第2天再按1∶100的菌液與培養(yǎng)基的比例轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)至2～3 h，將培養(yǎng)后的菌液用MH 肉湯培養(yǎng)基稀釋成106個(gè)mL-1的菌懸液，向無(wú)菌的96 孔平板中的第1～11 列中各加入100μL 菌懸液，12 列不加菌液而加營(yíng)養(yǎng)肉湯作為陰性對(duì)照.然后從1～10 列中逐一加入100μL 用新鮮MH 肉湯配制的抗菌肽(AMPs)，11 列作為陽(yáng)性對(duì)照孔不加AMPs，37℃，90 r·min-1恒溫培養(yǎng)20 h.用DG5033A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm 下對(duì)平板進(jìn)行掃描，按照低于50%對(duì)照孔(11 孔)生長(zhǎng)以上的最小質(zhì)量濃度計(jì)算抗菌劑的最小抑菌濃度(MIC)值［13］.

1.3 大腸桿菌的紫外線(xiàn)誘變

在菌種誘變前，先打開(kāi)8W的紫外燈預(yù)熱30 min，使光波穩(wěn)定，照射距離為40 cm.取無(wú)菌的帶有磁力攪拌器的無(wú)菌培養(yǎng)皿，加入細(xì)胞密度為107～108個(gè)mL-1的菌懸液;將待處理的培養(yǎng)皿置于誘變箱內(nèi)的磁力攪拌儀上，靜止1 min后開(kāi)啟磁力攪拌儀旋紐進(jìn)行攪拌，然后打開(kāi)皿蓋，分別處理0，30，60，90 ，120，150 s，照射完畢后先蓋上皿蓋，再關(guān)閉紫外燈和攪拌器;分別取對(duì)照組和不同處理時(shí)間的菌液0.5 mL 進(jìn)行適當(dāng)稀釋(10-4，10-5，10-6)，將這3個(gè)稀釋度傾注在LB 固體培養(yǎng)基平板上(每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù))，37℃避光培養(yǎng)20 h，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，用于計(jì)算紫外線(xiàn)誘變致死率［14］.

1.4 濃度梯度平板法篩選抗鱟素菌株

將不同時(shí)間誘變后的部分菌液，分別涂布于從低到高濃度的鱟素梯度LB 瓊脂糖培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)20 h后，分別挑取生長(zhǎng)在高濃度鱟素平板上的大腸桿菌ATCC25922，JM109和對(duì)照平板上的單菌落，接種于MH 肉湯培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，方法參考1.2.

1.5 抗藥性的判定折點(diǎn)

文獻(xiàn)關(guān)于細(xì)菌對(duì)AMPs 抗藥性的判斷折點(diǎn)不盡相同.MARTINEZ 等［15］通過(guò)測(cè)定誘導(dǎo)菌株與原始菌株的MIC，來(lái)判定其抗藥性，把細(xì)菌對(duì)AMPs的抗藥性定義為:誘導(dǎo)后菌株與對(duì)照組菌株的MIC值相比顯著性提高.本研究中，通過(guò)鱟素對(duì)原始菌株、相應(yīng)對(duì)照誘導(dǎo)菌株和誘導(dǎo)菌株的MIC 測(cè)定，如果誘導(dǎo)菌株與對(duì)照組菌株的MIC 值相比提高2倍以上，判斷為誘導(dǎo)出抗藥性，否則表明在此實(shí)驗(yàn)條件下鱟素不能誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性.

1.6 對(duì)誘變菌株的進(jìn)一步篩選

將通過(guò)紫外線(xiàn)誘導(dǎo)獲得的抗鱟素耐藥菌株，在含有1/2MIC 濃度鱟素的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代N次后，采集誘導(dǎo)不同代的誘導(dǎo)菌株，進(jìn)行MIC 測(cè)定.與此同時(shí)，在相同條件下，每代設(shè)不加鱟素的培養(yǎng)基連續(xù)傳代菌株，作為對(duì)照選擇菌株，把添加鱟素誘導(dǎo)的菌株作為陽(yáng)性選擇菌株.參考上述1.5 方法，判定有無(wú)更高抗鱟素菌株的產(chǎn)生.

1.7 耐藥穩(wěn)定性測(cè)定

將獲得的抗鱟素耐藥菌株，在不含鱟素的MH肉湯培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代，每20 h 轉(zhuǎn)種1次，連續(xù)轉(zhuǎn)種5次后，將每次轉(zhuǎn)種形成的各子代菌株以15%甘油-70℃冰箱中保存，分別測(cè)定其MIC 值，以觀(guān)察其耐藥表型的穩(wěn)定性.

1.8 抗生素對(duì)鱟素抗藥菌株的敏感性測(cè)定

鹽酸左氧氟沙星和注射用芐星青霉素對(duì)抗鱟素菌株的敏感性測(cè)定，參考1.4.

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線(xiàn)誘變大腸桿菌劑量的選擇

由圖1可知，隨著誘變劑量的遞增，大腸桿菌ATCC25922和JM109的致死率逐漸上升，表明誘變時(shí)間和大腸桿菌的存活率之間存在一定的正比關(guān)系.當(dāng)誘變時(shí)間≥60 s 時(shí)，死亡率已經(jīng)超過(guò)75%.在輻射強(qiáng)度和輻射距離一定的情況下，大腸桿菌ATCC25922和JM109的致死率與輻射時(shí)間成正比(圖1).

圖1 不同劑量紫外線(xiàn)照射大腸桿菌的致死率Fig.1 The death rate of Escherichia coli induced by different ultraviolet radiation dose

由靶子學(xué)說(shuō)可知，紫外線(xiàn)在誘變作用之初，菌株數(shù)目很大，而此時(shí)的輻射劑量很少，輻射作用呈單擊現(xiàn)象，此時(shí)紫外光照射作用的效率很高.隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，存活的菌株逐漸減少，變異菌株逐漸增加，突變率增大.由圖1可知，在照射90 s后，菌株已大部分死亡，照射時(shí)間的增加已不能引起更多的變異.這時(shí)死亡的菌株被多次擊中的機(jī)會(huì)增加，以致大部分的能量被死亡的菌株吸收，突變率下降較快，效應(yīng)曲線(xiàn)趨于平穩(wěn).因此，可將混合菌紫外照射的最佳時(shí)間確定在菌株存活率從急劇下降到趨向平穩(wěn)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)上，即照射時(shí)間為90 s.紫外照射時(shí)間為90，120，150 s的菌種致死率均大于90%，因此，經(jīng)初步篩選，挑選照射時(shí)間為60，90，120 s的菌株作進(jìn)一步篩選.

2.2 抗鱟素菌株的篩選

隨機(jī)挑取生長(zhǎng)在高鱟素濃度梯度培養(yǎng)基平板上誘變時(shí)間為60 s 9株，90 s 7株和120 s 8株的大腸桿菌ATCC25922 菌株，以及不同誘變時(shí)間的各9株JM109 菌株，分別與相應(yīng)的對(duì)照組菌株進(jìn)行MIC的測(cè)定.從大腸桿菌ATCC25922和JM109 藥敏試驗(yàn)的結(jié)果可知，鱟素對(duì)大腸桿菌ATCC25922和JM109的MIC分別為5，10 mg·L-1.大腸桿菌ATCC25922 經(jīng)紫外線(xiàn)誘變處理后，獲得了MIC為10 mg·L-1的抗鱟素大腸桿菌ATCC25922-A1-90和大腸桿菌ATCC25922-A2-902株，以及MIC為20 mg·L-1的抗鱟素大腸桿菌ATCC25922-A1-601株;大腸桿菌JM109 經(jīng)紫外線(xiàn)誘變處理后，它們中大部分呈負(fù)突變，MIC 值由10 mg·L-1降低為5 mg·L-1，一部分MIC 維持不變，如圖2和圖3.

從圖2可知，大腸桿菌ATCC25922 在紫外線(xiàn)誘變時(shí)間為60，90 s 時(shí)，有正突變菌株產(chǎn)生，60 s的正突變率為14.29%，90 s的正突變率為22.22%，在紫外線(xiàn)誘變不同時(shí)間下的負(fù)突變率均大于正突變率.從圖3可知，本試驗(yàn)條件下，大腸桿菌JM109在紫外線(xiàn)誘變不同時(shí)間均未獲得抗鱟素的菌株.

對(duì)大腸桿菌ATCC25922 經(jīng)紫外線(xiàn)誘變產(chǎn)生的ATCC25922-A1-90，ATCC25922-A2-90，ATCC25922-A1-603株低抗鱟素菌株，分別經(jīng)過(guò)12 代1/2MIC 鱟素的連續(xù)傳代，它們的MIC 與傳代前均無(wú)變化，未誘導(dǎo)出更高抗藥性.

2.3 抗藥穩(wěn)定性測(cè)定

對(duì)誘導(dǎo)出的3株低抗鱟素菌株大腸桿菌ATCC25922-A1-90、ATCC25922-A2-90 以及AT CC25922-A1-60，在無(wú)藥MH 肉湯培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5次后，此3株菌株的MIC 值均無(wú)變化，結(jié)果表明，這3株低抗鱟素菌株的抗藥性較穩(wěn)定.

2.4 抗生素對(duì)低抗鱟素菌株的敏感性測(cè)定

抗生素對(duì)低抗鱟素菌株的敏感性測(cè)定結(jié)果如表1.由表1可知，注射用芐星青霉素對(duì)大腸桿菌JM109的MIC 是大腸桿菌ATCC25922的8倍，對(duì)大腸桿菌ATCC25922 經(jīng)紫外誘導(dǎo)出來(lái)的3株低抗鱟素菌株的MIC 比原始菌株提高了128倍以上.大腸桿菌ATCC25922 無(wú)論是誘導(dǎo)菌株還是原始菌株，以及大腸桿菌JM109 均對(duì)鹽酸左氧氟沙星敏感.總之，低抗鱟素菌株對(duì)芐星青霉素有顯著抗藥性，對(duì)鹽酸左氧氟沙星仍然敏感.

3 討論

AMPs 通常能快速殺死細(xì)菌并具有廣譜抗菌活性，一些研究者認(rèn)為它不易使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性.但是隨著對(duì)AMPs 研究的深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌也同樣會(huì)對(duì)某些AMPs 產(chǎn)生抗藥性［16～18］.研究表明，金黃色葡萄球菌能對(duì)防御素和人類(lèi)AMPs 產(chǎn)生抗藥性，并且金黃色葡萄球菌對(duì)防御素、細(xì)菌素和陽(yáng)離子AMPs的抗藥機(jī)制具有特異性［19］.因此，一種新的AMPs 產(chǎn)品細(xì)菌是否對(duì)其產(chǎn)生抗藥性成為問(wèn)題的關(guān)鍵性.

表1 3種抗菌劑對(duì)大腸桿菌MIC 比較Table 1 MIC comparison of three agents for Escherichia coli

紫外線(xiàn)作為一種物理誘變因子，具有誘變效果明顯和方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是誘發(fā)微生物突變的一種非常有用的工具，在生產(chǎn)和科研中可利用它獲得性能優(yōu)良的突變株.目前，紫外誘變?cè)谏锓乐畏矫鎽?yīng)用較多，如田連生等［20，21］2006年采用紫外線(xiàn)誘變處理與藥物培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)相結(jié)合的方法，分離篩選出對(duì)速克靈有顯著抗性的突變型木霉菌株UT-4，和對(duì)多菌靈具有明顯耐藥性的菌株T24-4和T24-6;詹儒林等［22］通過(guò)紫外線(xiàn)誘變獲得了對(duì)多菌靈的抗性菌株，試驗(yàn)證明其抗性可提高120倍以上.Pexiganan 是一種陽(yáng)離子AMPs magainin的類(lèi)似物，GE［23］對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌通過(guò)化學(xué)誘變或者紫外誘變方法，均未誘導(dǎo)出對(duì)Pexiganan抗藥性的菌株.

而本研究中，通過(guò)紫外線(xiàn)誘變大腸桿菌ATCC25922 篩選抗鱟素菌株，獲得3株低抗鱟素菌株，對(duì)于JM109 未誘導(dǎo)出抗鱟素菌株.對(duì)誘導(dǎo)菌株和原始菌株進(jìn)行抗生素和鱟素的敏感性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)菌株對(duì)鱟素的抗藥性?xún)H有輕微的提高，但對(duì)注射用芐星青霉素的抗藥性顯著性提高，對(duì)于此3株低抗鱟素菌株抗藥性機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究.因其AMPs的殺菌機(jī)制的獨(dú)特性，與抗生素相比，此結(jié)果進(jìn)一步暗示大腸桿菌通過(guò)誘變更易對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性.

在抗生素耐藥性日益嚴(yán)重、病毒病和腫瘤仍未攻克的今天，AMPs的出現(xiàn)無(wú)疑為人們尋找理想的抗菌、抗病毒和抗腫瘤藥物提供了新的領(lǐng)域，AMPs的應(yīng)用將給解決細(xì)菌抗藥性、藥物殘留等關(guān)鍵問(wèn)題帶來(lái)希望.

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