樊 東，郭博智，高艷玲，趙奎軍，王曉云

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

昆蟲幾丁質(zhì)脫乙?；福–hitin deacetylase，CDA，EC 3.5.1.41）是昆蟲體內(nèi)一類重要幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白，可分布在蟲體內(nèi)多個(gè)含幾丁質(zhì)成分組織結(jié)構(gòu)中，可將幾丁質(zhì)修飾為殼聚糖，在昆蟲生長、發(fā)育和代謝中具有重要作用[1]。根據(jù)功能域不同，把昆蟲CDA分為5類（Group）。第1類包含CDA結(jié)構(gòu)域、ChBD結(jié)構(gòu)域，還含有LDLa結(jié)構(gòu)域；第2類結(jié)構(gòu)域與第1類的CDA一致，但是序列差異大；第3類和第4類都具有CDA與ChBD結(jié)構(gòu)域，不含有LDLa結(jié)構(gòu)域，但是第3類和第4類CDA的結(jié)構(gòu)域在CDA上的位置存在較大程度差異，第5類CDAs只含有CDA結(jié)構(gòu)域，不具有ChBD與LDLa結(jié)構(gòu)域。棉鈴蟲中克隆得到3個(gè)CDA基因分別屬于2個(gè)不同的CDA類型，Group I和Group V；粉紋夜蛾和蓓帶夜蛾中的CDA屬于Group V；家蠶中的2個(gè)CDA屬于Group I；赤擬谷盜中克隆的9個(gè)CDA屬于5個(gè)不同的類型Group I到Group V；苜蓿夜蛾中CDA屬于Group V，而甘藍(lán)夜蛾的CDA則屬于Group I和Group V[2－4]。目前鱗翅目昆蟲克隆的CDA主要集中在Group I和Group V中。

昆蟲中CDA功能了解不多，有些功能還局限于推測階段，并沒有得到試驗(yàn)驗(yàn)證。目前對(duì)粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、蓓帶夜蛾（Mamestra configurata）和赤擬谷盜（Tribolium castaneum）等幾種昆蟲的CDA活性和功能進(jìn)行研究。粉紋夜蛾CDA研究表明，幼蟲腸中的CDA只在幼蟲取食期表達(dá)，當(dāng)幼蟲停止取食時(shí)，中腸中的CDA表達(dá)也隨之停止，其功能可能與圍食膜的更新密切相關(guān)[5]。蓓帶夜蛾CDA在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白具有酶活性，同時(shí)在蟲體內(nèi)也檢測到CDA活性[6]。蓓帶夜蛾CDA的研究結(jié)果推測CDA的作用可能是參與改變圍食膜中幾丁質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，而這一生化活動(dòng)不僅改變幾丁質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)，且對(duì)圍食膜蛋白的結(jié)合程度、圍食膜的完整性和孔隙率產(chǎn)生影響[1]。在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）中，克隆得到2個(gè)能編碼具有典型CDA功能域的CDA，通過氣管上幾丁質(zhì)的脫乙?；拗茪夤苎娱L[7－8]。對(duì)赤擬谷盜（Tribolium castaneum）中的9個(gè)CDA進(jìn)行研究，TcCDA1和TcCDA2在表皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，TcCDA1還在幼蟲氣管中表達(dá)，TcCDA6到TcCDA9在中腸內(nèi)特異性表達(dá)，TcCDA3在胸部肌肉內(nèi)表達(dá)，TcCDA4則在早期的成蟲附肢內(nèi)表達(dá)，甘藍(lán)夜蛾的2個(gè)CDA均可在中腸內(nèi)表達(dá)，但其中一種CDA亦可在其他組織中進(jìn)行表達(dá)[9]?？梢奀DA功能可能存在多樣性[1]。隨著越來越多CDA從不同昆蟲中克隆出來，有必要對(duì)昆蟲CDA進(jìn)行深入的功能和相關(guān)機(jī)理研究。

小地老虎（Agrotis ipsilonHufnagel）屬鱗翅目夜蛾科，為世界性害蟲，在我國各地都有分布，食性雜，能危害36科100多種植物。輕發(fā)生時(shí)造成缺苗斷壟，重發(fā)生時(shí)田塊可造成幾乎無苗或毀種[10]。本研究對(duì)小地老虎幾丁質(zhì)脫乙?；富騝DNA進(jìn)行克隆，獲取基因cDNA全長序列，并對(duì)該基因在大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行研究，為該基因進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx為小地老虎，利用黑光燈在田間誘集成蟲，室內(nèi)飼以5%蜂蜜水使其產(chǎn)卵并用大豆葉作飼料喂養(yǎng)到不同發(fā)育階段備用。

1.1.2 主要試劑及菌株

RNA提取試劑盒TRIzol?Reagent購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶M－MLV Reverse Transcriptase、蛋白 Marker、低熔點(diǎn)瓊脂糖購自 Fermentas（FBI）公司；T4DNA連接酶、克隆載體pMD18－T、DNA膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker、TaKaRa 5'－Full RACE Kit購自TaKaRa公司，其余試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純；受體菌DH5α、BL21、載體PET21b由本研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

將小地老虎五齡幼蟲轉(zhuǎn)移到研磨器中，按每100 mg蟲體加入TRIzol?Reagent 1 mL進(jìn)行研磨，提取RNA，具體步驟參見TRIzol試劑盒使用說明，提取得到的RNA放入－80℃冰箱中備用。

1.2.2 第一鏈cDNA的合成

以 dt－Adapter： 5'GACTCGAGTCGACATCGA（T）173'為cDNA合成引物，利用反轉(zhuǎn)錄酶M－MLV Reverse Transcriptase合成第一鏈cDNA，具體參照M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明。

1.2.3 利用RT－PCR技術(shù)克隆基因cDNA序列片段

比較棉鈴蟲（Helicoverpa armigera，EU325568）、苜蓿夜蛾（Heliothis viriplaca，GU188855）兩種昆蟲幾丁質(zhì)脫乙?；富虻腸DNA序列，設(shè)計(jì)1對(duì)適用于克隆小地老虎CDA的引物。CDA：5'GTG CTGCCTGACTGCTTC 3'和 antiCDA：5'AAGTGT TCCGTTGAAGGA 3'。以合成的cDNA為模板，以CDA和AntiCDA為引物擴(kuò)增小地老虎幾丁質(zhì)脫乙?；竎DNA序列的特異片段。

PCR反應(yīng)條件均為：94℃預(yù)變性5 min；94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產(chǎn)物回收，與pMD18－T vector連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定。連接正確的重組子由南京金斯瑞生物工程公司進(jìn)行序列測定。用克隆到的CDA的部分序列，設(shè)計(jì)5'和3'RACE引物。

1.2.3.1 克隆cDNA全長序列

根據(jù)所得基因片段設(shè)計(jì)3'端上游引物CDA1：5'CTCGATTGATGAAATCCTGTCGAGTC 3'，與引物Adapter進(jìn)行PCR克隆基因的3'端序列，電泳、回收、測序等反應(yīng)同上。

使用TaKaRa 5'－Full RACE Kit進(jìn)行5'RACE試驗(yàn)，根據(jù)試劑盒中的Outer Primer和Inner Primer設(shè)計(jì)克隆CDA基因5'端序列的引物。引物序列分別為CDA outer primer：5'AGCGTTACTCCAGAAGCG TTCGT 3'；CDA inner primer：5'AAAGTATGTAGC CTTAATGTCGCAACCGTTAGGG 3'，試驗(yàn)按照試劑盒說明進(jìn)行，電泳、回收、測序等反應(yīng)同上。

拼接全長序列，根據(jù)拼接所得基因序列設(shè)計(jì)3'端以及5'端引物擴(kuò)增得到小地老虎CDA全長序列。

1.2.3.2 序列分析

得到的核苷酸序列使用NCBI中的Blast搜索，得到與克隆目的基因同源性較高的鱗翅目昆蟲CDA核苷酸序列；使用InforMax軟件中的AlignX對(duì)所得序列和已知昆蟲的CDA基因進(jìn)行同源性分析；使用Clone軟件找到序列的ORF、酶切位點(diǎn)以及翻譯得到氨基酸序列；利用ExPASy網(wǎng)站（http://us.expasy.org/tools/dna.html）的蛋白分析軟件推導(dǎo)得到氨基酸序列的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)；利用Expasy molecular biology server的Scanprosite facility對(duì)推導(dǎo)得到的氨基酸結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。

1.2.4CDA基因在大腸桿菌中的表達(dá)

利用Clone軟件找到CDA序列的ORF，并根據(jù)載體PET21b的載體圖設(shè)計(jì)表達(dá)引物，上游含有SalⅠ酶切位點(diǎn)，CDASalⅠ：5'ACGCGTCGACAT GGCGCGCTACGCCCGTGTCGCTACTC 3'；下游含有XhoⅠ酶切位點(diǎn)，CDAXhoⅠ：5'CCGCTCGAGGT AACGGCCGTCACCCGTGGGGTCGTTCAG 3'，PCR。回收產(chǎn)物、提取得到PET21b質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，T4連接酶16℃過夜連接。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到BL21中，使用表達(dá)引物對(duì)菌液進(jìn)行PCR，電泳。含有目的條帶的菌液培養(yǎng)后提取少量質(zhì)粒，XhoⅠ單酶切，XhoⅠ與SalⅠ雙酶切鑒定重組陽性克隆，挑選含有目的片段的陽性克隆測序。測序正確的重組克隆使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS－PAGE凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 小地老虎CDA cDNA序列的獲得

小地老虎CDA的cDNA序列大小為2 048 bp（見圖1）。該基因已經(jīng)在GenBank登記，登錄號(hào)為JQ012932。該基因包括一個(gè)1 626個(gè)堿基的開放讀碼框，編碼541個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為61.7 ku。

2.2 小地老虎CDA氨基酸序列分析

利用Expasy molecular biology server的 Scanprosite facility對(duì)推導(dǎo)的小地老虎幾丁質(zhì)脫乙?；赴被岬慕Y(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最顯著的特點(diǎn)是含有三個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域，幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)[Chitin binding Peritrophin－A domain（50－103）]，低密度脂蛋白受體區(qū)[Low－density lipoprotein receptor class A domain（LDLa）（124－158）]，幾丁質(zhì)催化區(qū)[Polysaccharide deacetylase domain（199－355）]。

用NetOGlyc軟件對(duì)小地老虎幾丁質(zhì)酶氨基酸序列在N－位上的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，CDA的氨基酸序列中存在3個(gè)N位糖基化位點(diǎn)，分別為246NYSA、276 NATV、298NITD，證明該蛋白序列均屬于糖蛋白，在昆蟲體內(nèi)需要經(jīng)過糖基化作用才能有效發(fā)揮酶活性。

圖1 小地老虎幾丁質(zhì)脫乙?；富駽DA cDNA序列和推測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of Agrotis ipsilon CDA cDNA

SignalP3.0進(jìn)行信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)cDNA推導(dǎo)的氨基酸的21和22位之間存在一個(gè)信號(hào)肽切割位點(diǎn)。

2.3 同源性分析

小地老虎幾丁質(zhì)脫乙?；赴被嵝蛄信c已經(jīng)克隆得到的其他鱗翅目幾丁質(zhì)脫乙?；感蛄羞M(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果見表1。小地老虎CDA氨基酸序列與棉鈴蟲（GQ411189），苜蓿夜蛾（GU188855）以及甘藍(lán)夜蛾（HQ680620）CDA氨基酸序列關(guān)系比較密切，一致性分別為97%、98%和99%，而與鱗翅目昆蟲家蠶（AK385842/AK378243）、棉鈴蟲（GQ－411190/GQ411191/EF600051）、粉紋夜蛾（AY966－402）、蓓帶夜蛾（EU660852/HM357864）和甘藍(lán)夜蛾（HQ680621）的CDA氨基酸序列同源性均低于40%。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，已登錄GenBank的CDA基因?qū)儆诓煌念惾?，本研究獲得的CDA與已有甘藍(lán)夜蛾（HQ680620）、棉鈴蟲（GQ411189）、苜蓿夜蛾（GU188855CDA）屬于同一類群，結(jié)合功能域分析它們屬于CDA家族中的第I組（Group I），而與其他CDA則分屬不同類群（見圖2）。

表1 不同鱗翅目昆蟲CDA基本特征及與小地老虎CDA序列的一致性Table 1 Characteristics of some chitin deacetylase from different lepidopteran insects and their amino acid identities with Agrotis ipsilon

圖2 登錄GenBank的鱗翅目昆蟲CDA聚類分析Fig.2 Phylogenetic tree of lepidopteran insects chitin deacetylase amino acid sequences

2.4 CDA原核表達(dá)結(jié)果

將PCR擴(kuò)增的CDA基因序列插入PET21b中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，經(jīng)過37℃、4 h誘導(dǎo)表達(dá)，獲得一條高表達(dá)的蛋白帶，經(jīng)過SDS－PAGE分析該蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量約為60 ku，與預(yù)期的融和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相同（見圖3）。

圖3 CDA誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE showing the induced expression of CDA

3 討論與結(jié)論

在害蟲的生物防治中，幾丁質(zhì)脫乙?；副蛔C明是潛在的殺蟲劑靶標(biāo)。該酶通過改變圍食膜幾丁質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成保護(hù)腸道免受病原物和毒素侵入。利用昆蟲CDA構(gòu)建重組病毒，可提高病毒的殺蟲活性[11－12]；利用RNA干擾技術(shù)對(duì)昆蟲CDA表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[13]，改變圍食膜的通透性，干擾昆蟲正常生長發(fā)育和新陳代謝過程以及抵抗病原物的特性。通過雙向調(diào)節(jié)，增加或降低CDA表達(dá)，干擾圍食膜中幾丁質(zhì)和殼聚糖組成，從而影響圍食膜正常結(jié)構(gòu)和功能，影響昆蟲生長、發(fā)育和代謝。作為害蟲防治的潛在方法，CDA在害蟲生物防治中具有應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)克隆得到的小地老虎幾丁質(zhì)脫乙?；竎DNA序列，通過與其他昆蟲CDA基因進(jìn)行同源性比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化分析，功能域預(yù)測，明顯可見小地老虎CDA基因?qū)儆诘谝环N類型。在以后的研究中將繼續(xù)克隆小地老虎其他類型CDA基因，進(jìn)一步完善昆蟲幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因拷貝數(shù)研究。

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