賈 雷，何湘麗，陶能國(guó)，周海恩

(湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南湘潭 411105)

柑橘是世界第一大水果、第三大國(guó)際貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品。2008年開(kāi)始，我國(guó)第一次超越巴西成為世界第一大柑橘生產(chǎn)國(guó)［1］。我國(guó)柑橘以鮮銷為主，成熟期基本集中在9～11月，加之柑橘主產(chǎn)區(qū)位于偏遠(yuǎn)的山區(qū)或農(nóng)村，需要一定的貯藏和運(yùn)輸周期加以調(diào)節(jié)市場(chǎng)供求的矛盾，在此期間大量的采后損失，如腐爛、營(yíng)養(yǎng)和水分損失常常發(fā)生，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。真菌病害侵染是導(dǎo)致貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中新鮮柑橘果實(shí)腐爛的最主要原因。引起柑橘果實(shí)在貯藏、運(yùn)輸期間腐爛的真菌性病害有綠霉病(Penicillium digitatum)、青霉病(P.italicum)、酸腐病(Oospora citriaurantii)、黑色蒂腐病(Diplodia natalensis)、褐色蒂腐病(Phomopsis cytosporella)、黑腐病(Alternaria citri)、炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)、褐腐病(Phytophthora citrophthora)等［3］。近年的研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)柑橘采后腐爛80%由綠霉(指狀青霉，P.digitatum)引起，其次是青霉(意大利青霉，P.italicum)，此兩類病害可導(dǎo)致柑橘采后腐爛率高達(dá)30%～50%［4］。越來(lái)越多的研究表明，柑橘精油及其潛在抑菌組分對(duì)意大利青霉和指狀青霉等多種果蔬致病菌有顯著的抑制作用，且具有高效、安全無(wú)毒、不易誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)，逐漸被人們關(guān)注并成功應(yīng)用于柑橘果實(shí)采后病害的控制實(shí)踐［5－10］。前期研究發(fā)現(xiàn)，椪柑精油對(duì)菌核青霉、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黃曲霉等多種食品致病菌具有很好的抑制作用，是一種潛在的廣譜生物殺菌劑［11－13］。本研究擬以椪柑為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò) GC/MS分析不同發(fā)育期果皮精油的組成，對(duì)比抑菌性能的變化，從中篩選出潛在的抑菌組分，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為柑橘采后貯藏保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

椪柑(C.reticulate Blanco)果實(shí)采自湘潭大學(xué)附近果園，采樣時(shí)間分別為2011年7月28日，8月28日，9月28日和10月28日，此時(shí)期為椪柑果實(shí)發(fā)育的膨大期;檸檬醛(95%)、壬醛(95%)、辛醛(99%)、癸醛(98%)、β－芳樟醇(95%)和 α－松油醇(90%) 購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;意大利青霉(P.italicum)、指狀青霉(P.digitatum) 均由湘潭大學(xué)生物與食品工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。

SPX－250B生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;BL320H電子天平 SHIMADZU公司;MLS－3020蒸汽滅菌器 日本SANYO電子有限公司;TDL5A臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司;FLC－3超凈工作臺(tái) 蘇州安瑞凈化公司;CL－100電爐 上海日用電爐。

1.2 椪柑精油的提取與分析

選取無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害和成熟度相同的椪柑果實(shí)，將果皮剝下，放置在40℃烘箱中干燥，粉碎呈直徑為6mm左右的塊狀，采用水蒸氣蒸餾提取果皮精油，無(wú)水硫酸鈉干燥后置于4℃冰箱密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

GC－MS分析條件如下:日本島津 GC－MS(2010QP－Plus)儀，HP－5MS型石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。氣相色譜條件:載氣為氦氣，柱流量為1.2mL/min，進(jìn)樣口溫度:250℃;分流比200∶1，檢測(cè)器溫度220℃。升溫程序?yàn)?起始溫度為40℃，保持 1min，然后以 3℃/min升到 70℃，保持1min，然后以5°C/min升到220°C 保持 10min;進(jìn)樣量為1μL。質(zhì)譜條件:接口溫度為220℃;離子源溫度200℃;電子轟擊(EI)離子源;電子能量70eV;質(zhì)量掃描范圍5～450m/z。

1.3 不同發(fā)育期椪柑精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉的作用

采用瓊脂稀釋培養(yǎng)法［14］研究不同發(fā)育期椪柑精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉菌絲體生長(zhǎng)的影響。椪柑精油對(duì)意大利青霉作用的終濃度依次為:0.00、0.31、0.62、1.50、2.50、5.00、10.0μL/mL;椪柑精油對(duì)指狀青霉作用的終濃度依次為:1.25、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0μL/mL。每個(gè)培養(yǎng)皿接入一個(gè)生長(zhǎng)一致的菌餅(d=6.0mm)，每處理重復(fù)3次，置28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，十字交叉法測(cè)量菌落直徑。以完全沒(méi)有菌絲生長(zhǎng)的最低濃度作為椪柑精油的最低抑菌濃度(MIC)［15］。用0.5%(v/v)的吐溫－80 和無(wú)菌水作為對(duì)照。

1.4 椪柑精油中幾種潛在抑菌成分對(duì)意大利青霉和指狀青霉的作用

采用瓊脂稀釋培養(yǎng)法［14］研究椪柑精油中6種潛在抑菌組分(檸檬醛、辛醛、壬醛、癸醛、β－芳樟醇和α－松油醇)對(duì)意大利青霉和指狀青霉菌絲體生長(zhǎng)的影響，各組分濃度依次為 0.00、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00、2.00μL/mL。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)三次重復(fù)，采用常規(guī)分析方法來(lái)標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，One－way ANOVA分析差異顯著性(p＜0.05)，不同濃度間比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 椪柑精油成分分析

從表1可以看出，不同發(fā)育期椪柑精油按照出峰順序共鑒定出約50種物質(zhì)，主要包括萜烯烴類化合物(80.26% ～87.60%)(v/v，下同)、醇(6.01% ～13.26%)、醛(4.51% ～5.63%)和醚(0.12%～0.33%)等萜烯類化合物。其中，含量最高的組分為檸檬烯(47.28%～58.40%)，約占總含量的一半，其次為γ－松油烯(8.27% ～13.23%)、β－ 芳樟醇(3.48% ～7.86%)、β－月桂烯(6.24%～7.50%)、α－蒎烯(5.07%～6.05%)、β－蒎烯(2.30%～3.45%)、辛醛(2.04% ～2.48%)和異松油烯(1.40%～2.09%)等。不同發(fā)育期果實(shí)的各種主要組分含量變化較為明顯，如主要組分檸檬烯的含量從7月的47.28%上升到10月的55.73%。一些潛在的抑菌組分含量也存在明顯變化，如辛醛含量從7月的2.04%增加到10月的2.48%，壬醛從0.27%增加到0.35%，癸醛從0.96%增加到1.50%;而α－檸檬醛從0.39%降低到10月的0.21%，β－芳樟醇從7.86%降低到3.48%，α－松油醇從1.59%降低到1.00%。通過(guò)比較不同發(fā)育期椪柑果皮精油各類化合物的含量可知，萜烯烴、大部分醛和醚類等化合物含量均呈上升趨勢(shì)，而醇類含量逐漸下降。

2.2 不同發(fā)育期椪柑精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉的作用

由表2可以看出，不同發(fā)育期椪柑精油均能抑制意大利青霉菌絲體生長(zhǎng)，以7月和8月的抑菌效果較為明顯，當(dāng)精油濃度為0.31μL/mL時(shí)既表現(xiàn)出顯著的抑制作用(p＜0.05);9月和10月果皮精油濃度達(dá)到0.62和1.25μL/mL時(shí)開(kāi)始顯著抑制意大利青霉生長(zhǎng);當(dāng)濃度為5.00μL/mL時(shí)，不同發(fā)育期果皮精油處理的意大利青霉菌絲體直徑與對(duì)照一樣，均為6.0mm，說(shuō)明意大利青霉菌絲生長(zhǎng)受到完全抑制。根據(jù)表2結(jié)果可以推斷，椪柑精油對(duì)意大利青霉MIC為5.00μL/mL。

由表3可以看出，不同發(fā)育期椪柑精油對(duì)指狀青霉的抑制作用相對(duì)較弱，濃度較低時(shí)對(duì)指狀青霉不起作用甚至促進(jìn)其生長(zhǎng)，當(dāng)濃度達(dá)到40.0μL/mL

時(shí)能完全抑制其生長(zhǎng)，且不同月間存在較大差別(表3)。如7月果皮精油濃度低于20.0μL/mL時(shí)基本無(wú)作用;9月果皮精油在較低濃度(1.25μL/mL)時(shí)不起作用，當(dāng)濃度為2.50μL/mL時(shí)顯著促進(jìn)指狀青霉生長(zhǎng)(p＜0.05)，濃度達(dá)到10.0μL/mL時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)抑制。根據(jù)表3結(jié)果可以推斷，椪柑精油對(duì)指狀青霉MIC 為40.0μL/mL。

表2 不同發(fā)育期椪柑精油對(duì)意大利青霉菌絲體生長(zhǎng)的影響(n=3)Table2 Effect of Ponkan essential oils at different ripening stage on mycelium of P.italicum(n=3)

2.3 椪柑精油中幾種潛在抑菌成分對(duì)意大利青霉和指狀青霉的作用

表4和表5的結(jié)果顯示，椪柑精油中6種潛在抑菌組分對(duì)意大利青霉和指狀青霉菌絲體生長(zhǎng)均有不同程度的抑制，以辛醛的抑制作用最強(qiáng)，β－芳樟醇和α－松油醇最弱，且不同菌株之間存在較大差別;β－芳樟醇對(duì)意大利青霉和指狀青霉菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯抑制需要一定的濃度(分別為0.50和0.25μL/mL)，α－松油醇對(duì)指狀青霉菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯抑制需要一定濃度(0.25μL/mL)，其余抑菌組分均在更小的濃度時(shí)(0.06或0.13μL/mL)表現(xiàn)出明顯的抑制(p＜0.05)。

表3 不同發(fā)育期椪柑精油對(duì)指狀青霉菌絲體生長(zhǎng)的影響(n=3)Table3 Effect of Ponkan essential oils at different ripening stage on mycelium of P.digitatum(n=3)

檸檬醛和辛醛對(duì)意大利青霉抑制作用最強(qiáng)，MIC均為0.50μL/mL，壬醛和癸醛對(duì)意大利青霉的 MIC均為1.00μL/mL，而β－芳樟醇和α－松油醇對(duì)意大利青霉的 MCI為2.00μL/mL(表4)。對(duì)指狀青霉而言，辛醛和壬醛的MIC為0.50μL/mL，癸醛的MIC為1.00μL/mL，檸檬醛、β－芳樟醇和 α－松油醇的 MIC均為2.00μL/mL(表5)。通過(guò)比較MIC可以看出，與椪柑精油的作用效果類似，所測(cè)6種抑菌成分對(duì)意大利青霉的作用效果要強(qiáng)于指狀青霉。

3 討論與結(jié)論

利用水蒸氣蒸餾法提取出不同發(fā)育期椪柑果皮精油，并通過(guò)GC－MS測(cè)定了其組成。與以往報(bào)道類似［11，16－17］，椪柑精油主要以烯烴類為主，占總組分的80.26%～87.60%，以檸檬烯的含量最高，達(dá)47.28%～58.40%，椪柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中醇類(6.01%～13.26%)和醛類(4.51%～5.63%)含量變化較大。醇類物質(zhì)中，β－芳樟醇含量隨著果實(shí)成熟急劇下降，從7月的7.86%下降到10月的3.48%;α－松油醇含量也略微下降，從7月的1.59%下降到10月的1.00%。醛類物質(zhì)中，辛醛從7月的2.04%增長(zhǎng)到10月的2.48%;壬醛在7月果皮精油中未檢測(cè)到，8月增加到0.27%，逐漸增加到10月的0.35%;α－檸檬醛從7月的0.39%下降到10月的0.21%。

表4 六種潛在抑菌組分對(duì)意大利青霉菌絲體生長(zhǎng)的影響Table4 Effect of six potential antifungal components on mycelium of P.italicum

表5 六種潛在抑菌組分對(duì)指狀青霉菌絲體生長(zhǎng)的影響Table5 Effect of six potential antifungal components on mycelium of P.digitatum

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同發(fā)育期椪柑精油對(duì)意大利青霉菌絲體的抑制作用要強(qiáng)于指狀青霉，當(dāng)精油濃度為5.00μL/mL時(shí)，就可以完全抑制意大利青霉的生長(zhǎng);而要完全抑制指狀青霉生長(zhǎng)，精油濃度需達(dá)到40.0μL/mL。出現(xiàn)這一結(jié)果可能與不同青霉菌株有關(guān)［13，18］，也可能與其所含的組分有關(guān)。通常認(rèn)為，植物精油的抑菌性能歸功于精油中某種單一組分或多種次要組分(minor compounds)的復(fù)合拮抗效應(yīng)［19］。如前所述，椪柑精油中含有檸檬醛、辛醛、壬醛、癸醛、芳樟醇和α－松油醇等組分，這些組分已被證實(shí)對(duì)青霉菌生長(zhǎng)有不同程度的抑制［5，18－22］。本研究分析了上述組分對(duì)意大利青霉和指狀青霉菌絲體生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，6種抑菌組分中辛醛的效果最好，其次為檸檬醛、壬醛、癸醛、β－芳樟醇和α－松油醇;0.50μL/mL檸檬醛可完全抑制意大利青霉的生長(zhǎng)，而完全抑制指狀青霉菌絲生長(zhǎng)的濃度需達(dá)到2.00μL/mL;0.50μL/mL辛醛可完全抑制意大利青霉和指狀青霉的生長(zhǎng);β－芳樟醇和α－松油醇的濃度需要達(dá)到2.00μL/mL才可以完全抑制意大利青霉和指狀青霉的生長(zhǎng)。

比較不同成熟期果皮椪柑精油的組成可以看出，隨著果實(shí)發(fā)育，椪柑果皮中的抑菌物質(zhì)如辛醛、癸醛和壬醛含量逐漸增加，而檸檬醛、芳樟醇和α－松油醇等含量逐漸下降。與之對(duì)應(yīng)的是，精油的抑菌性能總體相對(duì)穩(wěn)定，MIC值保持一致，說(shuō)明這幾種抑菌物質(zhì)含量的變化在一定程度上決定了椪柑精油的抑菌效果。但不同月精油也存在細(xì)微的差別，如7月和8月果皮精油對(duì)意大利青霉的抑菌效果要好于9、10月;8、9月果皮精油對(duì)指狀青霉的抑菌效果優(yōu)于7月和10月，且9月果皮精油低濃度(2.50μL/mL)還促進(jìn)指狀青霉生長(zhǎng)。出現(xiàn)這種情況可能與椪柑精油中的其他待鑒定的抑菌物質(zhì)有關(guān)，也可能與其中促進(jìn)生長(zhǎng)的物質(zhì)如檸檬烯、β－蒎烯和 β－月桂烯有關(guān)［6，8－9，18，23］。

綜上可知，椪柑精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑菌作用主要取決于檸檬醛、辛醛、壬醛、癸醛、β－芳樟醇和α－松油醇等的復(fù)合作用。本實(shí)驗(yàn)研究了單一組分的抑菌作用，雙組分或多組分的復(fù)合效應(yīng)有待下一步研究，相關(guān)研究正在進(jìn)行中。

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