趙升強(qiáng)，歐仕益，邱瑞霞

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州 510632)

綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸，異名咖啡鞣酸，化學(xué)名3－O－咖啡?？崴幔侵参锝?jīng)莽草酸途徑代謝產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物［1－2］。綠原酸具有多種生物活性，如清除自由基、降壓、預(yù)防誘變和癌腫、護(hù)肝利膽、抗菌消炎等［3－6］。它不僅可以入藥，而且廣泛應(yīng)用于保健食品。因綠原酸主要存在于忍冬科忍冬屬、菊科蒿屬等植物中［7］，目前綠原酸的提取分離研究大都集中于杜仲、金銀花等藥用植物，而從大眾作物廢料如薯類洗液中進(jìn)行提取的研究并不多。馬鈴薯中的酚酸含量占干重的0.1%～0.3%，芽中含量高達(dá)0.8%，約有50%存在于皮及鄰近組織中，而馬鈴薯酚酸中90%為綠原酸［8－11］。馬鈴薯在我國(guó)種植廣泛，且其產(chǎn)量逐年上升，其產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益越來(lái)越受到人們關(guān)注，國(guó)內(nèi)馬鈴薯精制淀粉以20%的速度增長(zhǎng)，馬鈴薯休閑食品的生產(chǎn)也日趨火熱［12］，馬鈴薯加工業(yè)不斷擴(kuò)大發(fā)展，其生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生大量馬鈴薯洗液，現(xiàn)階段都以廢水形式處理掉。而馬鈴薯洗液中含有大量水溶性酚酸，馬鈴薯去皮去芽清洗過(guò)程酚酸大都隨洗液流失掉，因此從馬鈴薯洗液中提取綠原酸具有重要意義。大孔樹(shù)脂因具有良好的吸附性能，吸附迅速，解吸容易等特點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于水溶性化合物的純化［13］。從馬鈴薯洗液中提取綠原酸尚未見(jiàn)諸報(bào)道，但歐仕益［14］等人發(fā)現(xiàn)D201樹(shù)脂能從麩皮類酶解液中有效分離阿魏酸，傳統(tǒng)方法如沉淀法和萃取法多用于較高綠原酸含量植物組織中綠原酸的提取［15］，而預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)馬鈴薯洗液中綠原酸含量較低且利用傳統(tǒng)方法中的乙醇沉淀法和乙酸乙酯萃取法提取綠原酸并不可行。本文對(duì)D201對(duì)綠原酸的吸附解吸特性進(jìn)行基礎(chǔ)研究，旨在為采用D201從馬鈴薯洗液中提取綠原酸進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D201、AB－8 安徽三星樹(shù)脂科技有限公司;D301 蘇州爭(zhēng)光樹(shù)脂有限公司;綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 湖南懷化盛德生物科技有限責(zé)任公司;無(wú)水乙醇、氯化鈉、鹽酸、冰醋酸 均為分析純。

自制馬鈴薯洗液(馬鈴薯洗凈去皮，清洗，切成厚1～2mm，長(zhǎng)款1～2cm 的薄片，清洗，合并洗液)。

UV－9600紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;SHA－BA水浴恒溫振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠;部分自動(dòng)收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司;玻璃柱(10mm×300mm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樹(shù)脂預(yù)處理［14］樹(shù)脂用去離子水浸泡24h，然后用2倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%HCl浸泡3h，適當(dāng)攪拌，然后用去離子水洗至中性;然后用2倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH浸泡3h，不時(shí)攪拌，然后用去離子水洗至中性，用去離子水浸泡備用。

1.2.2 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 用量筒量取3mL經(jīng)預(yù)處理的各種型號(hào)濕樹(shù)脂于具塞錐形瓶中，加入8mg/mL綠原酸溶液，置于30℃搖床中在90r/min下震搖24h，測(cè)定上清液中綠原酸濃度，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)綠原酸的吸附量;然后將上述樹(shù)脂用5BV去離子水清洗后加入洗脫劑(去離子水∶無(wú)水乙醇∶濃鹽酸 =24∶25∶1(V/V/V))，置于 30℃搖床中在 90r/min下震搖24h，測(cè)定上清液中綠原酸濃度，計(jì)算樹(shù)脂解吸率。

解吸率(%)=樹(shù)脂解吸綠原酸質(zhì)量(mg)/樹(shù)脂吸附綠原酸質(zhì)量(mg)×100

1.2.3 樹(shù)脂對(duì)綠原酸的最低吸附濃度的確定 取10mL樹(shù)脂于150mL具塞錐形瓶中，加入濃度為1mg/mL的綠原酸溶液100mL，于室溫下攪拌達(dá)到吸附平衡，測(cè)定上清液中綠原酸濃度，得到該樹(shù)脂的最低吸附濃度。

1.2.4 樹(shù)脂對(duì)綠原酸的吸附動(dòng)力學(xué) 分別取5.0mL樹(shù)脂于7個(gè)100mL具塞錐形瓶中，分別加入8mg/mL的綠原酸溶液50mL置于30℃搖床中在90r/min下震蕩，分別于 0.5、1、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5h 取 20mL 樣品測(cè)定溶液綠原酸濃度，根據(jù)吸附率隨吸附時(shí)間的變化關(guān)系得到吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

吸附率(%)=樹(shù)脂吸附綠原酸質(zhì)量(mg)/吸附前溶液中綠原酸質(zhì)量(mg)×100

1.2.5 洗脫劑的選擇 取10mL樹(shù)脂裝柱，將100mL 8mg/mL綠原酸溶液(自然pH)以9BV/h過(guò)柱完后用5BV去離子水洗滌，再用100mL不同配比的洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫流速為6BV/h，測(cè)定洗脫液中綠原酸的濃度，確定最適洗脫劑。

1.2.6 動(dòng)態(tài)洗脫曲線繪制 取10mL樹(shù)脂裝柱，將一定量綠原酸過(guò)柱完后用5BV去離子水洗滌，采用一定量洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫流速為6BV/h，每次收集9mL洗脫液測(cè)定綠原酸濃度。以洗脫液中綠原酸濃度為縱坐標(biāo)，洗脫液體積(按柱體積計(jì))為橫坐標(biāo)繪制動(dòng)態(tài)解吸曲線。

1.2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 向1L自制馬鈴薯洗液中加入100mL樹(shù)脂后攪拌2h，后用500mL洗脫劑洗脫1.5h，洗脫液真空低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙醇，然后用HPLC［16］測(cè)定吸附前和解吸后溶液中綠原酸純度，為防止樣液褐變，向樣液中加入100mg NaHSO［17］3。

1.2.8 綠原酸含量測(cè)定［18］精確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品299.9mg，用50%甲醇定容至100mL。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，用 50% 甲醇定容至100mL，在波長(zhǎng)326nm下測(cè)定吸光度，同時(shí)用50%甲醇溶液作為空白，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.0523C－0.0045(R2=0.9994);根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品液中綠原酸濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹(shù)脂確定

吸附量和解吸率是評(píng)價(jià)樹(shù)脂性能的重要指標(biāo)，由表1中可以看出，D201和D301都有較高的吸附量和解吸率，D301吸附量最大。取10mL樹(shù)脂采用濕法裝柱，將100mL 8mg/mL綠原酸溶液(自然pH)以9BV/h過(guò)柱后按1.2.6法對(duì)D201和D301進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫。

表1 不同樹(shù)脂的綠原酸吸附容量與洗脫效果Table1 Adsorption and desorption capacity of three kinds of resins for chlorogenic acid

圖1是D201和D301動(dòng)態(tài)洗脫曲線。從圖中可以看出，D201具有較高初始洗脫濃度且洗脫峰集中;采用5BV洗脫液洗脫時(shí)，D201洗脫率可達(dá)82%，而D301僅有55.1%;兩者總體洗脫率D201為91.7%而D301為82.8%。最低吸附濃度也是評(píng)價(jià)樹(shù)脂樹(shù)脂吸附特性的重要指標(biāo)，它衡量樹(shù)脂在什么濃度以上能從提取液中有效吸附綠原酸。經(jīng)測(cè)定，D201對(duì)綠原酸的最低吸附濃度為0.6μg/mL。綜合考慮，選擇D201作為研究對(duì)象。

圖1 D201和D301動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.1 Desorption dynamic curves of D201 and D301 resins for chlorogenic acid

2.2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)

吸附速率也是評(píng)價(jià)樹(shù)脂的一個(gè)重要指標(biāo)，選用的樹(shù)脂應(yīng)該不僅具有高的吸附量，而且具有快速達(dá)到吸附平衡的能力。實(shí)驗(yàn)表明:D201對(duì)綠原酸吸附速度較快，2h后已基本達(dá)到吸附平衡(圖2)。

2.3 洗脫劑的選擇

實(shí)驗(yàn)研究了不同配比的洗脫劑對(duì)綠原酸的洗脫效果(表2)。從表中可以看出，含鹽酸的洗脫劑洗脫效果最為理想，最高可達(dá)91.72%;乙醇濃度對(duì)解析效果亦有重要影響，實(shí)驗(yàn)表明50%(V/V)乙醇最為合適。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)乙醇濃度高于60%時(shí)洗脫會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，低于40%時(shí)洗脫效果不理想。綜合考慮，以選擇無(wú)水乙醇∶濃鹽酸∶去離子水 =50∶2∶48(v/v/v)洗脫劑為宜。

圖2 吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Adsorption kinetic of D201 resins for chlorogenic acid

表2 洗脫劑配比對(duì)洗脫效果的影響Table2 Effect of elution solutions on the desorption capacity of D201 for chlorogenic acid

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

圖3～圖5分別是綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，綠原酸提取濃縮液和馬鈴薯洗液的HPLC圖，從中看出經(jīng)過(guò)D201吸附后，洗脫液中的雜質(zhì)大幅減少，綠原酸濃度和純度都得到較大提升。

圖3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.3 The HPLC of standard chlorogenic acid sample

3 結(jié)論

圖4 綠原酸洗脫液HPLC圖Fig.4 The HPLC of chlorogenic acid in eluting sample

圖5 綠原酸馬鈴薯洗液HPLC圖Fig.5 The HPLC of chlorogenic acid in potato washing water

D201對(duì)綠原酸具有較大吸附容量，易被解吸且洗脫效果好，并能在極低濃度溶液中發(fā)生吸附。綠原酸的最佳洗脫劑配比為無(wú)水乙醇∶濃鹽酸∶去離子水=50∶2∶48(v/v)。實(shí)驗(yàn)表明可利用D201提取純化馬鈴薯洗液中綠原酸，但提取工藝有待進(jìn)一步優(yōu)化，且添加的NaHSO3對(duì)綠原酸提取率的影響有待進(jìn)一步研究。

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