李秀娣，毛光明

（1.杭州市標(biāo)準(zhǔn)化研究院，浙江杭州 310005；2.浙江省疾病控制中心，浙江杭州 310051）

微囊藻毒素（microcystin，MC）是一類主要由藍(lán)藻產(chǎn)生的一類環(huán)狀七肽的肝毒素[1]，其毒性作用的靶器官為肝臟，可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，并提高肝癌的發(fā)病率[2]，近年來有研究表明，該毒素亦可特異性分布于腎臟，并可能產(chǎn)生腎毒性[3]。微囊藻毒素-LR（MC-LR）是最為常見的一類。微囊藻毒素廣泛分布于我國淡水水系中，水體中MC-LR 總含量通常在0.1 μg/L～1 μg/L，水華大量腐敗消解時，最大可在80 μg/L～90 μg/L 左右[4]。該毒素可以通過淡水水生生物富集進(jìn)入食物鏈，間接危害人類健康[5]。同時，該毒素亦可污染飲用水源[6-7]。由于該毒素結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能抵抗pH 變化和高溫，且不易被沉淀和吸附[8-9]，因此，飲用水中去除MC-LR是非常困難的。目前尚未有實驗室條件下關(guān)于短期直接飲用含不同劑量MC-LR 的飲用水導(dǎo)致實驗動物肝臟和腎臟損傷的研究。

本實驗通過對SD 大鼠的飲用的蒸餾水中添加低毒和高毒劑量的純MC-LR，觀察不同劑量的MC-LR對臟器系數(shù)、肝腎功能和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響，探索MC-LR 污染飲用水后，對機(jī)體損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

200 g 左右的SD 大鼠：浙江省實驗動物中心。

微囊藻毒素（MC-LR）：美國Sigma 公司；丙二醛（MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、過氧化氫酶（CAT）測試盒：上海工碩生物技術(shù)有限公司。

7600 全自動生化分析儀：日本Hitachi 公司；UV754 型紫外可見光分光光度計：上海光譜儀器有限公司；LG10-2.4A 型離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；D-37520 低溫高速離心機(jī)：Thermo，德國。

1.2 方法

1.2.1 飲用水中MC-LR 對大鼠毒性模型的建立

飲用水中MC-LR 對大鼠毒性的實驗?zāi)Ｐ?，如?所示。

表1 飲用水中MC-LR 對大鼠毒性的實驗?zāi)Ｐ蚑able 1 The SD rat model for toxicity effect testing of MC-LR

選用SD 大鼠54 只，按表1 隨機(jī)分為9 組，每組6 只。將MC-LR 溶于大鼠的日常飲用的蒸餾水中至質(zhì)量濃度為8 μg/L（低毒組）和80 μg/L（高度組）；對照組不加MC-LR，用以喂養(yǎng)大鼠2 周。在實驗期間，動物自由進(jìn)食進(jìn)水，室溫保持在（20±1）℃，濕度為（45±10）%，并保持12 h 的晝夜循環(huán)。

1.2.2 樣品采集

各組分別在給藥后的1、7 和14 d 處死前稱重。

開腹，腹主動脈取血法采血，部分取全血置于肝素處理的離心管中，其余置于普通離心管中析出血清；指標(biāo)檢測前，所有血液樣本均3 000 r/min 離心，取上清測定。取血完畢后立即處死大鼠，分離出肝、腎，用于后續(xù)測定。

1.2.3 臟器系數(shù)的測定

分離出肝、腎后，立即于分析天平上稱質(zhì)量，計算大鼠肝臟和腎臟系數(shù)。

1.2.4 肝腎功能的測定

運用全自動生化分析儀采用酶促反應(yīng)速率法檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST），堿性磷酸酶（ALP），肌酐（Cr），尿素氮（BUN）。

1.2.5 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定

采用試劑盒方法測定血清SOD，CAT 活性和MDA含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠體重增長情況

口服MC-LR 對大鼠體重增長情況的影響，見表2。

表2 口服MC-LR 對大鼠體重增長情況的影響（n=6）Table 2 The effects of MC-LR on the weights of SD rats（n=6）

實驗期間未出現(xiàn)動物意外死亡。如表2 所示，飼養(yǎng)后第1 天，三組體重差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。飼養(yǎng)后第7 天和第14 天，低毒組動物體重與對照組比較，無差異（P＞0.05）。但高毒組動物體重與對照組和低毒組比較，體重增長明顯減緩，差異有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 口服MC-LR 對臟器系數(shù)的影響

口服MC-LR 對大鼠臟器系數(shù)的影響，見表3。

根據(jù)表3 可知，飼養(yǎng)后第1 天，3 組肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)之間，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。低毒組飼養(yǎng)后第7 天和第14 天，肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)與對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高毒組飼養(yǎng)后第7 天和第14 天后，肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)較對照組和低毒組極顯著增加（P＜0.01）。

表3 口服MC-LR 對大鼠臟器系數(shù)的影響（n=6）Table 3 The effects of MC-LR on the organ function of SD rats（n=6）

2.3 口服MC-LR 對肝臟酶學(xué)指標(biāo)ALT、AST 和ALP的影響

口服MC-LR 對肝臟酶學(xué)指標(biāo)的影響，見表4。由表4 可知，對照組飲用蒸餾水，各時間點之間肝功能指標(biāo)無顯著改變（P＞0.05）。飼養(yǎng)后第1 天，三組的肝臟酶學(xué)指標(biāo)，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。飼養(yǎng)后第7 天和第14 天后，低毒組各項指標(biāo)，較對照組均有所升高，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高毒組的ALT，AST 和ALP 指標(biāo)出現(xiàn)極顯著增加（P＜0.01），并且隨著時間的推移，高毒組各項指標(biāo)呈極顯著增加趨勢（P＜0.01）。

表4 口服MC-LR 對肝臟酶學(xué)指標(biāo)的影響（n=6）Table 4 The effects of MC-LR on the liver function of SD rats（n=6）

2.4 口服MC-LR 對腎臟酶學(xué)指標(biāo)CR 和BUN 的影響

口服MC-LR 對腎臟酶學(xué)指標(biāo)的影響，見表5。

表5 口服MC-LR 對腎臟酶學(xué)指標(biāo)的影響（n=6）Table 5 The effects of MC-LR on the kidney function of SD rats（n=6）

根據(jù)表5 的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果，對照組飲用蒸餾水，各時間點之間腎臟酶學(xué)指標(biāo)無顯著改變（P＞0.05）。飼養(yǎng)后第1 天，三組的腎臟酶學(xué)指標(biāo)，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。飼養(yǎng)后第7 天和第14 天，低毒組各項指標(biāo)，較對照組均有所升高，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高毒組的與對照組和低毒組相比，CR 和BUN極顯著增加（P＜0.01），且隨著時間的推移，高毒組各項指標(biāo)明顯升高（P＜0.05）。

2.5 口服MC-LR 對大鼠血清抗氧化活性的影響

口服MC-LR 對氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響，見表6。

表6 口服MC-LR 對氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響（n=6）Table 6 The effects of MC-LR on the oxidative stress of SD rats（n=6）

如表6 所示，對照組飲用蒸餾水，各時間點之間血清中過氧化氫酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量基本沒有變化（P＞0.05）。低毒組的CAT，SOD 在飼養(yǎng)后第1 天，7 天和14 天較對照組出現(xiàn)極顯著升高；高毒組的CAT，SOD 在飼養(yǎng)后第1 天和第7 天較對照組出現(xiàn)極顯著升高；氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物，丙二酸（MDA）低毒組在飼養(yǎng)后第7 天出現(xiàn)顯著增加（P＜0.05），低毒組在飼養(yǎng)第14 天，高毒組在飼養(yǎng)后第7 天和第14 天出現(xiàn)極顯著增加（P＜0.01）。

隨著時間變化，低毒組CAT 值在飼養(yǎng)第7 天較第1 天顯著升高（P＜0.05），但第14 天變化不大。高毒組CAT 值在飼養(yǎng)第7 天較第1 天極顯著升高（P＜0.01），但第14 天較第1 天和第7 天都出現(xiàn)極顯著降低（P＜0.01）。低毒組SOD 值飼養(yǎng)后的各時間點未出現(xiàn)顯著改變（P＞0.05）。高毒組SOD 值在飼養(yǎng)第7 天較第1 天極顯著升高（P＜0.01），但在飼養(yǎng)第14 天較第1 天和第7 天極顯著降低（P＜0.01）。高毒組和低毒組MDA 值在飼養(yǎng)后的各時間點都呈極顯著升高趨勢（P＜0.01）。

3 討論

本實驗采用蒸餾水添加MC-LR 的方法對大鼠進(jìn)行飼喂，研究SD 大鼠在短期持續(xù)性暴露MC-LR 后機(jī)體損傷的情況和損傷機(jī)制。經(jīng)過7 天和14 天的暴露后，低毒組生長狀況良好，肝腎系數(shù)未出現(xiàn)顯著改變。說明低濃度MC-LR 的短期持續(xù)暴露對肝腎影響較小，不引起肝臟和腎臟的質(zhì)量增加。高毒組大鼠的體重增加出現(xiàn)明顯抑制，并且肝腎系數(shù)出現(xiàn)了顯著增加，說明對高濃度MC-LR 的短期持續(xù)性暴露會導(dǎo)致肝臟和腎臟發(fā)生了出血和腫脹等反應(yīng)[10-11]，引起肝腎質(zhì)量增加，解毒功能失代償，進(jìn)而影響到大鼠攝食和體重增加。

通過對實驗動物肝腎功能的監(jiān)測，低毒組的肝功能酶學(xué)指標(biāo)ALT，AST 和ALP 以及腎功能指標(biāo)CR 和BUN 在觀測期間均未出現(xiàn)顯著異常，說明大鼠的肝臟和腎臟在對MC-LR 的低濃度短期持續(xù)暴露的損傷是可修復(fù)或者可代償?shù)模虼宋磳?dǎo)致功能性的損傷。然而當(dāng)對MC-LR 進(jìn)行高濃度短期持續(xù)暴露，就會導(dǎo)致肝腎功能嚴(yán)重受損。高毒組出現(xiàn)肝功能酶學(xué)指標(biāo)和腎功能指標(biāo)極顯著增加，表現(xiàn)出功能性的失代償。且這種損傷是難以修復(fù)的，表現(xiàn)為隨著時間的推移，肝腎功能指標(biāo)進(jìn)行性的增加。這一表現(xiàn)說明了短期高濃度持續(xù)暴露MC-LR 之后，肝腎功能的損傷會加重和不可逆。短期高濃度持續(xù)暴露之后，MC-LR 存在蓄積效應(yīng)，可以推測，當(dāng)?shù)蜐舛乳L期暴露的話，蓄積到一定的劑量，會引起類似的損傷。也說明實驗動物對大劑量的MC-LR 的接觸缺乏良好的解毒機(jī)制。

CAT、SOD 是生命體在自我保護(hù)過程中兩種非常重要的生物活性物質(zhì)，多存在于過氧化物酶體內(nèi)；是機(jī)體消除在新陳代謝和損傷修復(fù)過程中產(chǎn)生的氧自由基，對抗和阻斷氧自由基對細(xì)胞造成損傷的重要的抗氧化劑[12]。當(dāng)這兩種物質(zhì)的活性受到抑制，就會出現(xiàn)氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA 生成的增加。因此，CAT 和SOD 活性可間接反應(yīng)機(jī)體清除自由基的能力。而MDA 是氧自由基攻擊細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸后形成的脂質(zhì)過氧化物，MDA 的水平可以間接反映細(xì)胞膜損傷的程度[13-14]。

本實驗表明，當(dāng)短期低濃度接觸MC-LR 之后，機(jī)體的CAT 和SOD 活性都出現(xiàn)顯著性的升高，隨著時間的推移，CAT 先增加而維持不增，而SOD 保持相對穩(wěn)定的水平，說明CAT 比SOD 的敏感性高。在接觸初期，MDA 水平保持不增，但隨著時間的推移，MDA 出現(xiàn)極顯著性增加。說明在短期低濃度持續(xù)性接觸MCLR 后，機(jī)體自身的抗氧化系統(tǒng)不足以對抗MC-LR 對細(xì)胞的損傷，盡管肝腎功能未出現(xiàn)顯著性異常，但細(xì)胞的損傷還是存在的?？梢酝茰y繼續(xù)長期接觸的話，將會導(dǎo)致肝細(xì)胞的反復(fù)損傷，進(jìn)而可能導(dǎo)致肝腎功能的失代償，甚至肝癌的發(fā)生，研究也表明，在肝癌高發(fā)地區(qū)的水源中可檢出高含量的微囊藻毒素[15-17]。

當(dāng)短期高濃度持續(xù)接觸MC-LR 之后，機(jī)體的CAT和SOD 活性先出現(xiàn)極顯著升高，接著出現(xiàn)抑制，這種抑制的程度，極顯著的低于正?；钚苑秶?。同時，MDA 水平出現(xiàn)極顯著的增加，并同時伴有肝腎功能的嚴(yán)重受損。持續(xù)暴露于高濃度的MC-LR 環(huán)境，會導(dǎo)致機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)受到抑制，從而出現(xiàn)了機(jī)體的失代償。

本實驗得出的結(jié)果表明，短期持續(xù)低濃度接觸MC-LR 對機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)影響較小，機(jī)體可以在一定程度上代償并恢復(fù)肝腎細(xì)胞的損傷，因此肝腎功能可不出現(xiàn)的異常。但短期持續(xù)高濃度接觸MC-LR 之后，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)將受到抑制，機(jī)體無法代償并出現(xiàn)嚴(yán)重的肝腎功能損傷，MC-LR 對機(jī)體的毒性存在蓄積效應(yīng)，生物體若長期持續(xù)暴露于MC-LR，將引起機(jī)體肝腎功能的失代償。因此有必要加強(qiáng)對飲用水中MC-LR 的監(jiān)測和清除工作。

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