殷海松，喬長(zhǎng)晟，秦韶燕，湯衛(wèi)華，賈士儒

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；3.瑞奇外科器械（中國(guó)）有限公司，天津 300457）

冬蟲(chóng)夏草是麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合體。主要分布于青海、西藏、四川、云南、甘肅、貴州等地高寒地帶和雪山草原等省區(qū)[1-2]。

冬蟲(chóng)夏草具有具有補(bǔ)虛損、益精氣、保肺、益腎、止血化痰、滋補(bǔ)強(qiáng)壯等功效等功效。蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草酸和蟲(chóng)草素是冬蟲(chóng)夏草的主要活性物質(zhì)[3]。但由于過(guò)度采集，自然界中野生蟲(chóng)草越來(lái)越少，而且價(jià)格很高。冬蟲(chóng)夏草液體發(fā)酵培養(yǎng)，國(guó)內(nèi)外均有很多研究報(bào)道，并有一系列藥品和保健食品在市場(chǎng)上銷售，而且經(jīng)多年的臨床使用，冬蟲(chóng)夏草人工菌絲制品的藥理作用與天然冬蟲(chóng)夏草幾乎一致[4]，個(gè)別有益指標(biāo)高于天然冬蟲(chóng)夏草，但其價(jià)格要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于天然蟲(chóng)草。因此通過(guò)冬蟲(chóng)夏草液態(tài)發(fā)酵獲得菌絲體和代謝產(chǎn)物非常有實(shí)際價(jià)值。

本文采用單因素試驗(yàn)法，優(yōu)化了冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵培養(yǎng)基，從而一定程度上提高了冬蟲(chóng)夏草生物量和胞外多糖產(chǎn)量。

1 材料和方法

1.1 菌株

冬蟲(chóng)夏草（Cordyceps sinensis.）：天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面種子培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）

培養(yǎng)基（A）：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO43.0 g/L、MgSO·47H2O 1.5 g/L 和土豆200 g/L。

培養(yǎng)基（B）：葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO40.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO·47H2O 0.5 g/L[5]。

培養(yǎng)基（C）：葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO·47H2O 0.5 g/L[6]。

培養(yǎng)基（D）：葡萄糖40 g/L、黃豆粉40 g/L、酵母膏5 g/L、KH2PO42.5 g/L、MgSO·47H2O 1.5 g/L[7]。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-2401 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本SHIMADZU公司；FA2004 電子天平：上海精科天平；梅特勒FiveGo便攜式pH 計(jì)：瑞士梅特勒托利多；DGG 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津天宇機(jī)電有限公司；LD5-10 型低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；YHG-Ⅱ迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 生物量的測(cè)定

(4)實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)物聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器集數(shù)據(jù)采集、匯集為一體，可以獨(dú)立記錄單點(diǎn)居室數(shù)據(jù)，未來(lái)推廣后也可做為匯聚層收集多個(gè)居室，跨區(qū)域居室的數(shù)據(jù)，有效了解城市不同區(qū)域內(nèi)環(huán)境情況，提供環(huán)境大數(shù)據(jù)分析參考依據(jù)。

取20 mL 搖瓶培養(yǎng)液，離心機(jī)4 000 r/min 離心20 min，除去上清夜，水洗、再離心，重復(fù)3 次。收集菌絲體，60 ℃烘干至恒重，在干燥器中冷卻到常溫，稱量。

1.4.2 冬蟲(chóng)夏草胞外多糖的提取與測(cè)定方法

1.4.2.1 胞外多糖的提取方法

將發(fā)酵液于4 000 r/min 離心20 min，得菌絲體和上清液；將上清液減壓濃縮或常壓蒸發(fā)濃縮，濃縮溫度不超過(guò)100 ℃，得黏稠狀液體；濃縮液加入2 倍體積的95%的乙醇醇析，其醇析時(shí)間不低于24 h，獲得白色纖維狀沉淀；將沉淀離心，沉淀用75%的乙醇洗滌數(shù)次；在60 ℃烘干，得灰白色粗多糖。

1.4.2.2 粗多糖的測(cè)定

將經(jīng)干燥至恒重的粗多糖直接用分析天平稱重。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

以4 種不同培養(yǎng)基為初始發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，冬蟲(chóng)夏草在培養(yǎng)過(guò)程中生物量和胞外多糖隨時(shí)間變化的曲線如圖1 所示，從圖1（a）中可知，冬蟲(chóng)夏草在以培養(yǎng)基（A）作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)要好于其它3 種培養(yǎng)基，獲得最大細(xì)胞干重為18.56 g/L。胞外多糖隨時(shí)間變化曲線如圖1（b）所示，從圖1（b）中可知，冬蟲(chóng)夏草在以培養(yǎng)基（A）作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)獲得了最大胞外多糖產(chǎn)量1.89 g/L，胞外多糖產(chǎn)量明顯高于其它3 種培養(yǎng)基。綜合考慮菌體量和胞外多糖產(chǎn)量，以培養(yǎng)基（A）做為冬蟲(chóng)夏草液態(tài)發(fā)酵的初始培養(yǎng)基。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖生產(chǎn)的影響Fig.1 Effects of fermentation mediums on cell growth and EPS production in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖生產(chǎn)的影響

圖2 碳源對(duì)冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖生產(chǎn)的影響Fig.2 Effects of carbon source on cell growth（a）and EPS production（b）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks.

冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程如圖2（a）所示，當(dāng)以葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖為初始碳源時(shí)獲得 最 大 細(xì) 胞 干 重 分 別 為17.405、17.015、10.870 和16.025 g/L，結(jié)果表明以葡萄糖為初始碳源時(shí)獲得的細(xì)胞干重最大，乳糖獲得的細(xì)胞干重最小。冬蟲(chóng)夏草胞外多糖生產(chǎn)的動(dòng)態(tài)過(guò)程如圖2（b）所示，當(dāng)以葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖為初始碳源時(shí)獲得最大胞外多糖產(chǎn)量分別為1.82、1.66、1.564 和1.96 g/L，從圖中可知麥芽糖最有利于胞外多糖生產(chǎn)，葡萄糖次之。72 h 之前，胞外多糖與細(xì)胞生長(zhǎng)呈一定的相關(guān)性，隨著菌體細(xì)胞生長(zhǎng)，胞外多糖也相應(yīng)增加72 h 以后，細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖生產(chǎn)有一定的背離（乳糖例外）。雖然麥芽糖最有利于胞外多糖生產(chǎn)，但是使用麥芽糖做碳源，成本太高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)，所以綜合考慮生物量和胞外多糖的產(chǎn)量，確定最適碳源為葡萄糖。

2.2.2 葡萄糖起始濃度對(duì)冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖生產(chǎn)的影響

葡萄糖起始濃度對(duì)蟲(chóng)草菌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響如圖3（a）所示。當(dāng)葡萄糖起始濃度為10、20、30、40 g/L 時(shí)，獲得的細(xì)胞干重分別是14.05、19.23、21.68、20.52 g/L。相應(yīng)的細(xì)胞平均生長(zhǎng)速率分別為2.299、3.163、3.613、3.420 g/（L·d）。結(jié)果表明當(dāng)葡萄糖起始濃度為30 g/L時(shí)獲得了最大的細(xì)胞干重21.68 g/L 和細(xì)胞平均生長(zhǎng)速率3.613 g/（L·d）。葡萄糖起始濃度對(duì)冬蟲(chóng)夏草胞外多糖生產(chǎn)的影響如圖3（b）所示。當(dāng)葡萄糖起始濃度為10、20、30、40 g/L 時(shí)，獲得最大胞外多糖產(chǎn)量分別為1.301、1.840、2.054、2.174 g/L。

圖3 葡萄糖起始濃度對(duì)冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖生產(chǎn)的影響Fig.3 Effect of initial glucose concentration，i.e.10，20，30，40 g/L on cell growth（a）and EPS production（b）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis

所以綜合考慮生物量和胞外多糖的產(chǎn)量，確定最適葡萄糖起始濃度為30 g/L。

2.2.3 氮源對(duì)冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖生產(chǎn)的影響

圖4 氮源對(duì)冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖生產(chǎn)的影響Fig.4 Effects of nitrogen source on cell growth（a）and EPS production（b）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks

冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程如圖4（a）所示，在起始氮源分別為蛋白胨、酵母粉、酵母膏、硫酸銨時(shí)，獲得了最大的細(xì)胞干重，分別為23.10、22.25、21.28、16.12 g/L。從圖中可知以蛋白胨為氮源時(shí)獲得了最大的細(xì)胞干重23.10 g/L，以硫酸銨為氮源時(shí)獲得的細(xì)胞干重最小16.12 g/L。從圖4（a）中可知在培養(yǎng)前期以硫酸銨為氮源時(shí)菌體生長(zhǎng)要快于其它3 種有機(jī)氮源，這是因?yàn)槲⑸飳?duì)無(wú)機(jī)氮源的利用一般比有機(jī)氮源快[8]。但是培養(yǎng)到72 h 后其它3 種有機(jī)氮源的細(xì)胞生長(zhǎng)要明顯快于硫酸銨，這是因?yàn)橛袡C(jī)氮源除含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸外，往往還含有少量的糖類，脂肪，無(wú)機(jī)鹽，維生素及某些生長(zhǎng)因子，尤其是其中的某些生長(zhǎng)因子可能會(huì)促進(jìn)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物合成。冬蟲(chóng)夏草胞外多糖生產(chǎn)的動(dòng)態(tài)過(guò)程如圖4（b）所示，在起始氮源分別為蛋白胨、酵母粉、酵母膏、硫酸銨時(shí)，獲得了最大胞外多糖產(chǎn)量分別為2.230、1.522、1.558、1.074 g/L。當(dāng)以蛋白胨為氮源時(shí)獲得的胞外多糖產(chǎn)量最大2.230 g/L，以硫酸銨為氮源時(shí)獲得的胞外多糖產(chǎn)量最小1.074 g/L，這可能是蛋白胨中含有的某些生長(zhǎng)因子有利于胞外多糖的生產(chǎn)。

所以綜合考慮生物量和胞外多糖的產(chǎn)量，確定最適氮源為蛋白胨。

2.2.4 蛋白胨起始濃度對(duì)冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖生產(chǎn)的影響

蛋白胨起始濃度對(duì)冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)的影響如圖5（a）所示，當(dāng)?shù)鞍纂似鹗紳舛葹?、10、15 g/L 和20 g/L 時(shí)，獲得的最大細(xì)胞干重分別為18.800、22.840、24.995 和23.795 g/L。結(jié)果表明當(dāng)?shù)鞍纂似鹗紳舛?5 g/L 時(shí)獲得了最大細(xì)胞干重，起始濃度5 g/L 時(shí)獲得的細(xì)胞干重最小。蛋白胨起始濃度對(duì)冬蟲(chóng)夏草胞外多糖生產(chǎn)的影響如圖5（b）所示，當(dāng)?shù)鞍纂似鹗紳舛葹?、10、15 g/L 和20 g/L 時(shí)，獲得的最大胞外多糖產(chǎn)量分別為2.069、2.338、2.802 和2.796 g/L。結(jié)果表明當(dāng)?shù)鞍纂似鹗紳舛?5 g/L 時(shí)更有利于冬蟲(chóng)夏草胞外多糖的生產(chǎn)。

圖5 蛋白胨起始濃度對(duì)冬蟲(chóng)夏草細(xì)胞生長(zhǎng)和胞外多糖生產(chǎn)的影響Fig.5 Effect of initial peptone concentration,i.e.5，10，15，20 g/L on cell growth（c）and EPS production（d）in submerged cultivation of Cordyceps sinensis in shake flasks

所以綜合考慮生物量和胞外多糖的產(chǎn)量。以15 g/L作為發(fā)酵培養(yǎng)基的起始氮源濃度。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定冬蟲(chóng)夏草液體發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基為：葡萄糖30 g/L、蛋白胨15 g/L、KH2PO43.0 g/L、MgSO4.7H2O 1.5 g/L 和土豆200 g/L。采用最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶培養(yǎng)條件下，獲得的最大生物量和最大胞外多糖產(chǎn)量分別為24.99 g/L 和2.80 g/L，比優(yōu)化前分別提高了34.6%和48.1%。

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