李海礁，喻東威，劉志楠，李欣，解鑫，劉曉川，趙媛，宋曉東，劉萍萍

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司質(zhì)量安全管理系統(tǒng)中心實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 011500）

黃曲霉毒素是黃曲霉、寄生曲霉、特異曲霉和假溜曲霉4 種產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物。飼料在自然條件下污染的黃曲霉毒素主要包括B1、B2、G1及G24 種，其中B1最多、G1次之，B2和G2很少[1]。因?yàn)辄S曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）的毒性與致癌性最大[2]。一般以AFB1作為飼料和糧食中黃曲霉毒素含量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)，所以我國(guó)只針對(duì)污染范圍最廣、危害最大的AFB1制定了限量[3]，其中玉米、玉米油、玉米制品中的限量水平均為≤20 μg/kg。

自20 世紀(jì)90 年代以來(lái)，現(xiàn)有的檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法主要有薄層色譜法（TLC）、液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫法（ELISA）[4-5]。其中，TLC法是檢測(cè)黃曲霉毒素的經(jīng)典方法，是中國(guó)測(cè)定食品及飼料中AFT 黃曲霉素B1（AFB1）的標(biāo)準(zhǔn)方法之一GB/T5009.23-2006《食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測(cè)定》；高效液相色譜法采用單克隆抗體免疫技術(shù)，通過(guò)黃曲霉毒素免疫親和柱可以將黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2分別進(jìn)行定量分析，所以此方法已被美國(guó)官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）確認(rèn)為官方檢測(cè)方法；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有比高效液相色譜法更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但這種方法還極少使用在測(cè)定組織中霉菌毒素的含量[6-7]；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)AFB1的理論基礎(chǔ)是通過(guò)抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，其采用單克隆或多克隆抗體技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、分析時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)主要采用高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法，對(duì)SGS 能力驗(yàn)證中心實(shí)驗(yàn)室制備的同一含黃曲霉毒素B1陽(yáng)性玉米粉樣品進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)比對(duì)，意在對(duì)以上兩種方法進(jìn)行對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1 材料

含黃曲霉毒素B1的玉米粉：SGS 能力驗(yàn)證中心實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 試劑與儀器

黃曲霉毒素B1快速定量檢測(cè)試劑盒：美國(guó)Helica公司；甲醇（色譜級(jí)）；苯（色譜純）；乙腈（色譜純）；氯化鈉（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；磷酸氫二鉀（分析純）；氯化鉀（分析純）；吐溫-20/PBS 溶液（0.1%）；黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：Supelcd 公司，LB92973，0.100 mg/mL；柱后衍生溶液（0.05%碘溶液）；

XS204 電子天平（感量0.1 mg）：Mettler Toledo 公司；ELX808 酶標(biāo)儀：450 nm，BioTek 公司；微量可調(diào)移液器：100 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL，Brand 公司；八道移液器：30 μL～300 μL，Brand 公司；加樣槽；DZSB-0882 高速均質(zhì)器：iUL 公司；黃曲霉毒素免疫親和柱：3 mL，VICAM；玻璃纖維濾紙（直徑11 cm，孔徑1.5 μm）；玻璃注射器（10 mL、20 mL）；高效液相色譜儀：戴安3000，帶熒光檢測(cè)器；色譜柱：Pickering 公司C18 柱。

1.3 方法

1.3.1 方法概述

酶聯(lián)免疫法：本方法測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有針對(duì)黃曲霉毒素B1的特異性單克隆抗體。加入黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液和黃曲霉毒素B1酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)黃曲霉毒素B1抗體，之后底物溶液在酶的作用下，由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色，最后加入終止液顏色由藍(lán)變?yōu)辄S色，在450 nm 處測(cè)量吸光度值，并計(jì)算樣品中黃曲霉毒素B1的濃度含量。

高效液相色譜法[8]：試樣經(jīng)過(guò)甲醇-水提取，提取液經(jīng)過(guò)濾、稀釋后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專(zhuān)一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水或吐溫-20/PBS 將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過(guò)免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過(guò)帶熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測(cè)定黃曲霉毒素的含量。

1.3.2 樣品前處理

酶聯(lián)免疫法：取代表性的粉碎樣品5.0 g 與25 mL 70%甲醇溶液混合，強(qiáng)力振蕩3 min，2 ℃～8 ℃3 000×g離心10 min，取清液用于檢測(cè)（稀釋倍數(shù)為5）。

高效液相色譜法：準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)過(guò)磨細(xì)（粒度小于2 mm）的試樣25.0 g 于250 mL 具塞錐形瓶中，加人5.0 g 氯化鈉及甲醇-水（7 ∶3，體積比）至125.0 mL，以均質(zhì)器高速攪拌提取2 min。定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取15.0 mL 濾液并加入30.0 mL 水稀釋?zhuān)貌ＡЮw維濾紙過(guò)濾1 次～2 次，至濾液澄清，備用。

1.3.3 參考色譜條件

流動(dòng)相：甲醇-水（45∶55，體積比）；流速：0.8 mL/min；柱后衍生化系統(tǒng)；衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生溶液流速：0.2 mL/min；反應(yīng)管溫度：700 ℃；反應(yīng)時(shí)間：1 min。

1.3.4 檢測(cè)步驟

酶聯(lián)免疫法：取足夠數(shù)量的預(yù)混孔插入微孔架，每孔加入200 μL 酶標(biāo)記物，100 μL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/kg）和樣品，并用移液器吹打至少3 次，充分混勻；轉(zhuǎn)移100 μL 預(yù)混孔中的液體至包被抗體的微孔中，室溫避光孵育15 min，洗板；加入100 μL 底物到微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育5 min；最后加入100 μL 停止液到微孔中充分混合，并在450 nm 處測(cè)量吸光度值。

高效液相色譜法：用進(jìn)樣器吸取100 μL 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值（峰高或峰面積），得到黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖。取樣品洗脫液1.0mL加入重蒸餾水定容至2.0 mL，用進(jìn)樣器吸取100 μL 注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定試樣的響應(yīng)值（峰高或峰面積）。經(jīng)過(guò)與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖比較響應(yīng)值得到試樣中黃曲霉毒素B1的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法檢測(cè)結(jié)果數(shù)值統(tǒng)計(jì)情況

針對(duì)同一黃曲霉毒素B1陽(yáng)性玉米粉樣品，在不同實(shí)驗(yàn)室間通過(guò)HPLC 法和酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測(cè)，所得樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1 所示。

表1 不同實(shí)驗(yàn)室間采用HPLC 法和ELISA 法檢測(cè)結(jié)果Table 1 The results among different laboratories by HPLC and ELISA

2.2 不同檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果與平均值的偏差情況

針對(duì)以上不同方法的檢測(cè)結(jié)果與樣品平均值進(jìn)行橫向比較，橫線(xiàn)為不同方法的平均值，具體結(jié)果見(jiàn)表2、圖1 和圖2。

表2 不同方法檢測(cè)結(jié)果與平均值的偏差情況Table 2 The deviation between detection results and the mean result

圖1 HPLC 法檢測(cè)結(jié)果分布圖Fig.1 The assay results of HPLC

圖2 ELISA 法檢測(cè)結(jié)果分布圖Fig.2 The assay results of ELISA

表1、表2、圖1 和圖2 結(jié)果顯示：同一樣品不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，HPLC 法檢測(cè)結(jié)果范圍在12.55 μg/kg～17.43 μg/kg 之間浮動(dòng)，平均值為15.65 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.90%；ELISA 法檢測(cè)結(jié)果范圍在14.10 μg/kg～18.20 μg/kg 之間浮動(dòng)，平均值為15.24 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.83%；由以上數(shù)據(jù)可以得到ELISA 法與HPLC 法檢測(cè)谷物中的黃曲霉毒素B1時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常一致，結(jié)果偏差較小。

3 討論

通過(guò)ELISA 法和HPLC 法所得玉米粉中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)結(jié)果可以看出，ELISA 法與HPLC 法檢測(cè)結(jié)果都比較穩(wěn)定，而且兩種方法的檢測(cè)結(jié)果也非常一致，由此可見(jiàn)ELISA 法與HPLC 法均可以用于檢測(cè)谷物中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。

自20 世紀(jì)90 年代以來(lái)，就高效液相色譜法而言，該方法通過(guò)預(yù)固相多功能萃取柱、免疫親和柱進(jìn)行前處理，并結(jié)合柱前、柱后衍生，采用熒光檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，有檢測(cè)靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，但該方法存在前處理步驟繁瑣，操作復(fù)雜，而且不能進(jìn)行大量樣本同時(shí)測(cè)定[9]，所以極大的限制了HPLC 法檢測(cè)黃曲霉毒素B1的應(yīng)用范圍。而ELISA 法在進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，樣品前處理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，方法快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定，而且檢測(cè)成本較低，設(shè)備場(chǎng)所要求低，樣品隨到隨檢，并且還可以同時(shí)處理大量樣本進(jìn)行檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[10]，所以在檢測(cè)谷物中黃曲霉毒素B1時(shí)，ELISA法將會(huì)得到更廣泛應(yīng)用。

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