梁 良，劉 羽，曹子青，楊亞軍，朱 華，黃 瀾，盛樹力，秦 川，鄧 巍

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所病理室，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021;2.山西省曲沃縣西街本草中藥研究所，山西 曲沃 043400)

阿爾茲海默病由 Alois Alzheimer在1906年首先報道［1］，它是老年人中最常見的癡呆類型，是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，是發(fā)達(dá)國家引起老年人死亡的重要原因之一［2］，其病理表現(xiàn)有細(xì)胞外老年斑沉積，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)、突觸丟失、神經(jīng)元炎癥和神經(jīng)元凋亡［3］。臨床表現(xiàn)主要為認(rèn)知下降和記憶損傷［4］。關(guān)于阿爾茲海默病的發(fā)病機(jī)制雖有很多假說，如淀粉樣蛋白級聯(lián)假說、Tau蛋白假說和膽堿能假說等，但發(fā)病機(jī)制仍不是很清楚。

目前還沒有能夠減慢或者停止阿爾茲海默病進(jìn)展的藥物，美國FDA批準(zhǔn)的5種藥物只能暫時緩解癥狀而且在病人中效果也不一致［5］?，F(xiàn)在對阿爾茲海默病的治療研究有抗淀粉樣蛋白和神經(jīng)元保護(hù)方法［6］。

本實驗室以前的研究發(fā)現(xiàn)，中藥I號方(PN-1)顯著提高給藥模型鼠的空間記憶力;能夠減少給藥模型鼠腦內(nèi)老年斑沉積并能夠降低腦內(nèi)Aβ水平，提高突觸可塑性相關(guān)分子的表達(dá)水平［7］。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，很有可能有若干個活性成分，通過多靶位起治療作用，而現(xiàn)在臨床上應(yīng)用的藥物只有一個作用靶點，多靶位治療有可能比單靶位療效更好。本實驗利用KinexTMAntibody Microarray這種高通量抗體芯片技術(shù)，篩選出給藥組與空白組模型鼠的差異表達(dá)蛋白，然后利用 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)這種生物信息學(xué)方法并結(jié)合文獻(xiàn)，從中找到與阿爾茲海默病相關(guān)的蛋白，揭示中藥的多靶位治療作用，為阿爾茲海默病的治療提供新的有效藥物。

1 材料與方法

1.1 中藥

中藥I號方由35味中藥組成，其粉劑用蒸餾水煮沸30 min，3次，將上清液合并調(diào)整至生藥濃度為1 g/mL，用時稀釋至0.1 g/mL。本實驗中的給藥濃度均折合生藥質(zhì)量進(jìn)行計算。

1.2 實驗動物

實驗中所用到的阿爾茲海默病小鼠模型為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型，是我所自己構(gòu)建的，模型以C57BL/6J小鼠為背景，為含有人APP瑞典突變和人PS1敲除了第九個外顯子而造成突變的雙轉(zhuǎn)基因小鼠。實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所病理室進(jìn)行【SYSK(京)2011-0022】。

1.3 分組及給藥

SPF級3月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，分為給藥模型組和空白對照組，其中給藥模型組為8只，雄性，每天灌胃給予2.4 g/kg中藥水提物，相當(dāng)于臨床用藥的36倍;空白對照組4只，雄性，給予等體積雙蒸水灌胃。給藥時間持續(xù)3個月。

1.4 腦蛋白提取及KinexTMAntibody Microarray分析

給藥結(jié)束后每組隨機(jī)取出三只分離出海馬后按下面過程提取蛋白:

1)每250 mg濕重的切碎的組織使用1 mL蛋白裂解液(北京博肽健諾威生物技術(shù)有限公司提供);

2)用冰冷PBS沖洗組織3次以去除血污染物;

3)勻漿機(jī)冰上搗碎組織，每次15 s，搗碎3次;

4)用超聲波探針粉碎核 DNA，粉碎次，每次10 s，每兩次之間隔 10～15 s，在此過程中，樣品須始終保留于冰上;

5)用臺式離心機(jī)上的最高速度 (14，000 r/min)，4℃離心樣品，30 min;

6)將上清液部分轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管;

8)使用BCA法測定樣品蛋白濃度，分裝至少100 μg 用于分析;

然后利用 KinexTMAntibody Microarray(北京博肽健諾威生物技術(shù)有限公司提供)分析差異表達(dá)蛋白，這種高通量抗體芯片技術(shù)能夠方便有效的幫助研究者發(fā)現(xiàn)有意義的結(jié)果，能夠分析蛋白表達(dá)、蛋白間的相互作用和蛋白的磷酸化。

1.5 利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)分析與阿爾茲海默病相關(guān)的蛋白分子

表1 阿爾茲海默病相關(guān)蛋白Tab.1 Proteins associated with Alzheimer’s disease

IPA是一種基于網(wǎng)頁的分析軟件。它能幫助研究者從多水平了解生物體，分析來自各種平臺的數(shù)據(jù)，使研究者深入理解分子和化學(xué)物質(zhì)間的相互關(guān)系、細(xì)胞表型和疾病過程。將來自 KinexTMAntibody Microarray分析的數(shù)據(jù)結(jié)果提交給IPA，并結(jié)合查閱文獻(xiàn)，分析與阿爾茲海默病相關(guān)的分子。

2 結(jié)果

將KinexTMAntibody Microarray分析后的結(jié)果，用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)并結(jié)合文獻(xiàn)分析后，得到與阿爾茲海默病相關(guān)的蛋白見表1。

3 討論

阿爾茲海默病是老年人中最常見的癡呆類型，到目前為止仍然沒有有效的治療方法，最終導(dǎo)致病人的死亡。在美國，阿爾茲海默病是引起死亡的第六大原因，在65歲以上老年人的死亡原因中居于第五位。隨著人口的老齡化，美國的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，到2050年，65歲以上的人口中患有阿爾茲海默病的人將達(dá)到11000000～16000000。給家庭和個人帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和精神壓力。

到目前為止對阿爾茲海默病的治療美國FDA共批準(zhǔn)了5種藥物，其中膽堿酯酶抑制劑類有四種tacrine，donepezil， rivastigmine 和 galantamine;NMDA受體拮抗劑有 Memantine［8］。但是這5種藥物均不能延緩或者是停止疾病的進(jìn)展，而且在病人中的效果也不一致［5］。除了以上5種 FDA批準(zhǔn)的藥物之外還有正在研究中的抗淀粉樣蛋白方法、他丁類、抗炎類以及Caspase抑制劑類等多種藥物［6］?？梢姮F(xiàn)在臨床上應(yīng)用的以及正在研究的藥物都是針對阿爾茲海默病的一個靶點而設(shè)計的。這可能正是現(xiàn)有藥物效果不好的原因，本中藥復(fù)方由35味中藥組成，成分復(fù)雜，運用 KinexTMAntibody Microarray這種新技術(shù)發(fā)現(xiàn)這種中藥復(fù)方能夠抑制神經(jīng)元凋亡、抑制炎癥、抑制 tau蛋白的過度磷酸化，提高記憶力。

中藥I號方(PN-1)具有抗tau蛋白過度磷酸化的作用。在給藥組，Tau蛋白T522磷酸化水平低于空白對照組。阿爾茲海默病病人腦Tau蛋白的磷酸化水平是正常人腦中的3～4倍，這些高度磷酸化的tau表現(xiàn)出了神經(jīng)元毒性，不僅不能跟微管蛋白結(jié)合，也不能促進(jìn)微管的組裝，反而抑制微管的組裝并破壞微管，在3×Tg阿爾茲海默病模型鼠中，同時減少可溶性淀粉樣蛋白和可溶性高磷酸化的tau能改善模型鼠的記憶力［9］。這表明降低 Tau蛋白的高度磷酸化可能為阿爾茲海默病的一個治療靶點。PN-1能抑制Tau蛋白的高度磷酸水平來改善阿爾茲海默病模型小鼠的病理生理學(xué)表現(xiàn)。

中藥I號方(PN-1)具有抗炎作用。在給藥組，COX2低于空白對照組。在阿爾茲海默病病人的腦中，炎癥瀑布升高，如激活小膠質(zhì)細(xì)胞、促炎因子、急性期蛋白和補(bǔ)體蛋白，研究表明阿爾茲海默病病人腦中 COX2的水平是升高的［10］。在腦中，COX2是一種促炎因子［11］。動物實驗表明抑制 COX2能提高小鼠的記憶力［12］。這表明PN-1可以通過抑制炎癥反應(yīng)來改善阿爾茲海默病模型小鼠的病理生理學(xué)表現(xiàn)。

中藥I號方(PN-1)具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。在給藥組Caspase6和Caspase9低于空白對照組;而抗凋亡蛋白Bcl-xl，在給藥組高于空白對照組。阿爾茲海默病病人病理表現(xiàn)之一是神經(jīng)元凋亡［3］，神經(jīng)元凋亡需要大量的caspase，到現(xiàn)在為止共有13類Caspase［13］。這表明 PN-1可能通過抑制細(xì)胞凋亡來改善阿爾茲海默病的病理生理學(xué)表現(xiàn)。

中藥 I號方(PN-1)具有提高記憶力的作用。在給藥組，CaMK4水平高于空白對照組。阿爾茲海默病病人的主要臨床表現(xiàn)是進(jìn)行性記憶力下降。研究發(fā)現(xiàn)CaMK4是記憶形成的正調(diào)節(jié)因子，他水平的升高能提高老年鼠的記憶力［14］。這表明PN-1可能通過提高記憶力來改善阿爾茲海默病的病理生理學(xué)表現(xiàn)。

以往的實驗研究發(fā)現(xiàn)中藥I號方(PN-1)能夠減少給藥模型鼠腦內(nèi)老年斑沉積，降低腦內(nèi)Aβ水平，促進(jìn)給藥模型鼠腦內(nèi)突觸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白水平的增加，提高給藥鼠的記憶力［7］。這表明中藥 I號方(PN-1)能通過多靶位改善阿爾茲海默病的病理生理表現(xiàn)，這為多靶位藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

［1］Herrup，K.Reimagining Alzheimer's disease—an age-based hypothesis［J］.The Journal of neuroscience，2010，30(50):16755-16762.

［2］Driscoll I，Troncoso J.Asymptomatic Alzheimer's disease:a prodrome or a state of resilience? ［J］.Curr Alzheimer Res，2011，8(4):330-335.

［3］MedeirosR， LaFerla FM. Astrocytes: conductors ofthe Alzheimer disease neuroinflammatory symphony ［ J］.Experimental neurology，2013，239:133-138.

［4］Price DL，Tanzi RE，Borchelt，DR.，et al.Alzheimer's disease:genetic studies and transgenic models［J］.Annual review of genetics，1998，32:461-493.

［5］Alzheimer's Association.2012 Alzheimer's disease facts and figures［J］.Alzheimer's dementia，2012，8(2):131-168.

［6］Singh S，Kushwah AS，Singh R，et al.Current therapeutic strategy in Alzheimer's disease［J］.European review for medical and pharmacological sciences，201216(12):1651-1664.

［7］Zhi-Gang Yao，Ling Zhang，Liang Liang，et al.Cognitiveenhancing effects of PN-1，a traditional Chinese prescription，in anAlzheimer's disease mouse model:Investigation of possible mechanisms of action［J］.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2013，Article ID 518421，12 pages.

［8］Van Marum RJ.Current and future therapy in Alzheimer's disease［J］.FundamentalClinical Pharmacology，2008，22(3):265-274.

［9］Iqbal K，Liu F，Gong CX，et al.Tau in Alzheimer disease and related tauopathies［J］.Current Alzheimer research，2010，7(8):656-664.

［10］Hull M，Lieb K，F(xiàn)iebich，BL.Anti-inflammatory drugs:a hope for Alzheimer's disease? ［J］.Expert opinion on investigational drugs，2000，9(4):671-683.

［11］Minghetti L.Cyclooxygenase-2(COX-2)in inflammatory and degenerative brain diseases［J］.Journal of neuropathology and experimental neurology，2004，63(9):901-910.

［12］Medeiros，R，F(xiàn)igueiredo CP，Pandolfo P，et al.The role of TNF-alphasignaling pathway on COX-2 upregulation and cognitive decline induced by beta-amyloid peptide［J］.Behavioural brain research ，2010，209(1):165-173.

［13］Raina AK，Zhu X，Shimohama S，et al.Tipping the apoptotic balance in Alzheimer's disease:the abortosis concept［J］.Cell biochemistry and biophysics，2003，39(3):249-255.

［14］Fukushima H，Maeda R，Suzui R，et al.Upregulation of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV improves memory formation and rescuesmemory loss with aging［J］.The Journal of neuroscience，2008，28(40):9910-9919.