左 琴，劉甦蘇，周舒雅，劉佐民，王金恒，范昌發(fā)

(中國食品藥品檢定研究院，國家嚙齒類實驗動物種子中心，北京 100050)

隨著轉基因和基因敲除模型動物模型的大量建立和廣泛使用，其保存和繁育體系的建立愈顯重要。模型動物的保存有活體保存和低溫冷凍保存兩種途徑，后者具有經(jīng)濟、降低模型動物遺傳漂變風險、避免因自然災害疾病原因引起的品種丟失等優(yōu)勢。與普通小鼠相比，轉基因模型動物的胚胎顯得更加嬌貴與脆弱，胚胎數(shù)量和質(zhì)量往往都不及普通動物。因而建立模型動物的低溫保種技術的難度更大。為了讓耗費大量經(jīng)費和經(jīng)過多年研究的模型動物品種資源得到妥善保存、以便為后續(xù)科研提供充足的動物，有針對性的研究和建立模式動物的低溫保種技術是非常有必要的［1］。

本研究在已有胚胎冷凍和體外受精技術基礎上，對本室自主建立的 C57-ras癌癥轉基因小鼠模型(專利公開號:CN101532018A)的低溫保種技術進行了研究。通過直接收集體內(nèi)發(fā)育的2-細胞胚胎或者通過體外受精方法獲得2-細胞胚胎，采用玻璃化冷凍法冷凍、復蘇、移植，后代經(jīng) PCR檢測，獲得了陽性的轉基因動物，建立了該轉基因動物品系低溫保種方法，而且在轉基因小鼠的保種中，利用體外受精的方式替代直接收集體內(nèi)發(fā)育的2-細胞胚胎，提高了保種的效率。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57-ras癌癥轉基因動物模型為本室自主建立(專利公開號:CN101532018A)，是通過將人原癌基因c-Ha-ras原核注射至C57BL/6J 1-細胞胚建立;其余小鼠包括SPF級C57BL/6J小鼠和KM小鼠均來自于本單位【SCXK(京)2009-0017】。所有小鼠飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境，飼喂SPF小鼠顆粒飼料，飲用滅菌自來水。溫度控制在(22 ±3)℃，自動光控(L∶D=12 h∶12 h，光照起始時間為 7∶00)。

1.2 主要儀器及試劑

CO2培養(yǎng)箱(Thermo 8000DH，美國)、體視顯微鏡(NIKON SMZ624，日本);孕馬血清(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)(均購于寧波第二激素廠，中國)、M2培養(yǎng)液(Sigma M7176，美國)和 KSOM 培養(yǎng)液(Millipore MR-106-D，美國)、DAP213凍存液和HTF培養(yǎng)液(日本熊本大學動物資源研發(fā)中心和上海斯萊克實驗動物有限責任公司贈送)。PCR檢測所用試劑(購于寶生物工程(TaKaRa)大連有限公司，中國)，引物由北京諾賽基因研究公司合成。

1.3 方法

1.3.1 胚胎采集［3］

取4周齡的C57BL/6J雌鼠，間隔48h分別注射PMSG和 hCG，各10 IU/只進行超排;待 hCG注射后與性成熟C57-ras雄鼠交配，次日晨檢陰道栓，見栓小鼠于hCG注射40 h后頸椎脫臼處死，取其輸卵管，M2培養(yǎng)液沖胚，在體視顯微鏡下回收形態(tài)正常的2-細胞期胚胎，清洗3次，移入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。

1.3.2 體外受精［4］

同上對4周齡C57BL/6J雌鼠超數(shù)排卵。在第二天取C57-ras雄鼠的精子進行精子培養(yǎng)獲能時，將注射hCG后15 h的C57BL/6J雌鼠頸椎脫臼處死，從輸卵管壺腹部取出卵母細胞團，放入已平衡12 h的HTF液中培養(yǎng)。

將2～3只10～15周齡的 C57-ras雄鼠頸椎脫臼處死，取其附睪上體尾部，用解剖針刺破后擠出精子團塊，放入在 CO2培養(yǎng)箱中已經(jīng)平衡12 h的HTF培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1 h。

在顯微鏡下檢查培養(yǎng)1h的精子懸浮液的精子活力和精子數(shù)量，然后用移液器取 10 μL(約含精子200個/μL)精子懸浮液，加入到已經(jīng)取出的卵母細胞團中，放入 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在實體顯微鏡下，挑選出發(fā)育正常的2-細胞期胚胎，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待凍存或胚胎移植。

1.3.3 胚胎冷凍和復蘇［5-6］

采用簡易玻璃化冷凍-解凍法凍存胚胎和復蘇胚胎。將待凍存的2-細胞胚置于1 mol/L DMSO液滴中靜置數(shù)分鐘，用微量移液器吸取5 μL含有所有胚胎的 DMSO于冷凍管中，在0℃恒溫器中平衡5 min，加入 DAP213溶液，再在 0℃條件下平衡 5 min后置于液氮中保存。

將凍存管從液氮中取出，室溫下靜置約30 s，加入9 mL 37℃預熱的0.25 mol/L蔗糖溶液，用移液器吹打10次，將溶液移入35 mm培養(yǎng)皿，室溫下靜置10 min，觀察記錄結果;將狀態(tài)良好的2-細胞胚移入KSOM培養(yǎng)液，放于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待移植。

1.3.4 胚胎移植［7］

2-細胞胚采用輸卵管移植法。結扎的KM雄鼠與正常KM雌鼠1∶1合籠，翌日檢查陰道栓，見栓記為假孕第1天。將復蘇胚胎移植至假孕1天母鼠的輸卵管內(nèi)，兩側各移植6～10個胚胎，出生后統(tǒng)計其產(chǎn)仔率。

1.3.5 PCR檢測

取離乳小鼠尾尖，按常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，PCR 反應條件是:94℃ 4 min，94℃ 45 s，68℃45 s，72℃ 2 min，72℃ 5 min，30 個循環(huán)。擴增目的片段大小為408 bp。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS7.1統(tǒng)計軟件，采用χ2檢驗進行結果分析。

2 結果

2.1 2-細胞期胚胎冷凍及復蘇結果

C57-ras轉基因雄鼠和普通 C57BL/6J雌鼠交配，獲得102枚2-細胞期胚胎。選擇其中90枚形態(tài)好的胚胎冷凍。共進行3次復蘇實驗，每次復蘇30枚凍存胚胎，平均復蘇成活胚胎20.33個，平均復蘇成活率是67.78%，3次復蘇組間第二組與其他兩組相比有極顯著差異(P＜0.01)。復蘇后分別移植到3只假孕鼠輸卵管中，總計獲得幼仔13只，得到3只陽性小鼠，見表1［8］?？梢?，轉基因動物胚胎冷凍較普通動物難度大，較難以把控，尤其對于純合致死的模型動物，保存胚胎有陽性小鼠的胚胎，也有野生型小鼠的胚胎，這意味著針對模式動物的胚胎冷凍技術，還需要進行大量的摸索。

2.2 體外受精結果

取C57-ras轉基因雄鼠精子與普通C57BL/6J雌鼠卵母細胞團在體外受精后，共收集到341個卵母細胞，其中有243個受精，有203枚胚胎發(fā)育到2-細胞期，平均體外受精率是58.49%，體外受精的3個分組間其中第一組的體外受精率是80.99%，與其他兩組相比有極顯著差異(P＜0.01)，這可能是第一組取的精液活率較高的原因，見表2。

2.3 體外受精2細胞胚胎冷凍復蘇結果

冷凍保存了203個體外受精的2細胞期胚胎，解凍復蘇了60個胚胎，平均復蘇率是63.33%，移植到2只假孕鼠輸卵管中，共產(chǎn)仔6只，見表3［8］。

2.4 通過PCR檢測產(chǎn)生移植產(chǎn)生小鼠

取移植產(chǎn)生的21只小鼠尾尖，提取基因組DNA后進行PCR檢測，以確定是否獲得含有轉基因的陽性小鼠。通過兩次重復檢測，發(fā)現(xiàn)有5只幼仔小鼠為轉基因陽性(圖1)。

表1 2-細胞胚冷凍復蘇結果Tab.1 Result of recovery of C57-ras transgenic mice froze 2-cell embryo

表2 體外受精結果Tab.2 Result of C57-ras transgenic mice IVF

表3 體外受精2細胞期胚胎冷凍復蘇結果Tab.3 Result of recovery of C57-ras transgenic mice IVF froze 2-cell embryo

圖1 PCR檢測c-Ha-ras轉基因小鼠中目的基因的插入Fig.1 Identification of human c-Ha-ras gene integration with PCR

3 討論

3.1 DAP213玻璃化冷凍方法

本研究以自主建立的C57-ras癌癥轉基因動物模型為材料，開展了模式動物的胚胎冷凍和體外受精技術探索，以期建立模型動物的低溫保存方法。通過直接收集2-細胞胚和經(jīng)體外受精獲得2-細胞胚，并經(jīng)過玻璃化冷凍方法凍存、復蘇、移植、檢測，最終兩種途徑均獲得陽性轉基因動物。胚胎冷凍技術方法主要有緩慢冷凍法和玻璃化冷凍法，兩種方法各有其優(yōu)點。玻璃化冷凍法因其對設備要求低，操作簡單，而被廣泛采用。Nakagata建立以DAP213為抗凍保護劑的玻璃化冷凍法已經(jīng)程序化，并出現(xiàn)了商業(yè)化的胚胎冷凍試劑盒，便于建立一種快速、經(jīng)濟、可靠的胚胎冷凍技術方法［9］。本實驗中采用了DAP213冷凍試劑盒冷凍2-細胞胚。通過3次實驗結果顯示，解凍后平均復蘇率為67.78%，移植后的產(chǎn)仔率為21.31%，子代中的陽性率為23.08%。徐平等比較了12個品系的小鼠體外受精后2細胞期胚胎的凍存復蘇率在58.12%～83.19%間，表明不同遺傳背景的小鼠間凍胚復蘇率有差異［10］。

Nakagata的玻璃化冷凍法較易掌握，在凍存胚胎時使用的是凍存管，與其他使用塑料細管的玻璃化冷凍法相比較，避免了復雜的裝管程序，單次凍存的胚胎量多。但是有數(shù)據(jù)表明2細胞期的胚胎解凍復蘇后，培養(yǎng)到擴張囊胚期的發(fā)育率，DAP213法是 39.1% ，EFS20/40 法是 93% ，后者更高［11］。

從原核期的胚胎到擴展囊胚期的胚胎，各個時期的胚胎都可以冷凍保存，對于近交系和轉基因小鼠，在超數(shù)排卵后，獲得的晚期胚胎數(shù)量少于早期胚胎，我們建議近交系和轉基因小鼠選擇凍存早期胚胎。

3.2 體外受精和胚胎冷凍結合保存種子資源

在轉基因小鼠的擴繁中，易出現(xiàn)繁殖能力低、食仔或不能自然交配等現(xiàn)象。采用體外受精技術，可以輔助不能自然交配或繁殖能力低的個體產(chǎn)生后代，在短時間內(nèi)快速獲得較多數(shù)量的動物。通過體外受精獲得小鼠胚胎并冷凍保存，這種方式可以較為安全的長期保存小鼠品系，通過移植也能較快的獲得轉基因活體動物，是目前保存小鼠遺傳資源的一種重要手段，同時也為轉基因小鼠模型推廣提供便利［12］。

常規(guī)冷凍保種的胚胎來源通常是需要數(shù)量較多的該品系雌鼠進行超排，交配成功的雌鼠取胚胎冷凍，但是轉基因小鼠品系通常提供不了大量的雌鼠，而體外受精解決了這個問題，采用1-2只陽性轉基因雄鼠和其背景來源的雌鼠體外受精，就可以獲得大量的胚胎，進行冷凍保存。

對來源于不同遺傳背景的35個小鼠品系超速排卵所得的卵母細胞與同品系小鼠精子進行體外受精研究表明，不同遺傳背景的小鼠體外受精差異顯著(P＜0.05)，受精率在 15.2% ～97.2%之間［10］。本實驗中采用 HTF為體外受精液，對 C57-ras轉基因小鼠體外受精中，受精率是59.53%，在對體外受精的2細胞期胚胎冷凍保存復蘇后，復蘇率是 63.33%，產(chǎn)仔率是 15.78%，后代陽性率是33.33%，和從體內(nèi)發(fā)育的2細胞期胚胎冷凍后的結果沒有差異，說明體外受精的胚胎可以作為一種胚胎來源方式進行冷凍保存。

［1］李勁松，成國祥，李厚達，等.胚胎冷凍技術在轉基因動物中的應用［J］.生物技術，1996，6(2):1-4.

［2］OECD guidelines for the testing of chemicals［W］.Test No.451:Carcinogenicity Studies［2008/2010］.http://www.oecd.org/dataoecd/30/46/41753121.pdf.

［3］Nagy A，Gertsenstein M.，Vinstersten K.，et al.Manipulating the Mouse Embryo.(THIRD EDITION) ［M］.USA.COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS，2003，141-175.

［4］豊田裕，橫山峰介，星冬四郎.マウス卵子の體外受精に關する研究，I精巢上體精子 にする 受精成績［J］.家畜繁殖志，1971，16(4):147-151.

［5］Nakagata N.High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification［J］.J.Reprod Fertil，1989，89:479-483.

［6］Nakao K， Nakagata N， KatsukiM. Simple and effcient procedureforcryopreservation ofmouseembryos bysimple vitrification［J］.Exp.Anim.1997，46:231-234.

［7］中瀉直已.マウスにおける經(jīng)卵管壁卵管內(nèi)胚移植の試み［J］.實驗動物，1992，41:387-388.

［8］周生來，董婉維，鄭志紅，等.胚胎冷凍技術應用于抗菌肽轉基因小鼠的保種傳代［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2007，8(17):484-486.

［9］熊本大學動物資源開発研究部門.Reproductive Engineering Techniques in Mice.(SECOND EDITION) ［W］.http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp.

［10］徐平，劉麗均，郁麗麗，等.系統(tǒng)低溫生物學技術在實驗小鼠資源保存中的建立與應用［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2009，8(19):9-14.

［11］梁洋，杜文敬，王春生，等.小鼠早期胚胎的 EFS20/40、EFS40、DAP213和GP25玻璃化法冷凍保存［J］.江西農(nóng)業(yè)大學學報，2010，6(32):9-14.

［12］徐平，山村綾子，唐一岷，等.不同品系小鼠的體外受精、胚胎冷凍及移植的比較研究［J］.中國實驗動物學報，2004，12(3):147-151.