高 梅，朱春花，曲保恩

(山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所，山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101)

水質(zhì)指的是水體的物理(如色度、濁度、臭味等)、化學(xué)(無(wú)機(jī)物和有機(jī)物的含量)和生物(細(xì)菌、微生物、浮游生物、底棲生物)的特性及其組成的狀況。實(shí)驗(yàn)室中的用水一般為飲用水、各種純化水、注射用水等。飲用水(Drinking water)為天然水經(jīng)凈化處理所得的水;純化水(Purified water)為原水經(jīng)蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其他適宜的方法制得的制藥用的水，不含任何附加劑;注射用水(Water for injection)是以純化水作為原水，經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的蒸餾器蒸餾、冷凝冷卻后經(jīng)膜過(guò)濾制備而得的水。《化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［1］規(guī)定:凡是注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應(yīng)的其他藥物制劑均應(yīng)進(jìn)行溶血性試驗(yàn)，附錄中溶血試驗(yàn)方法推薦的陽(yáng)性對(duì)照管為蒸餾水。為比較飲用水、各種純化水、滅菌注射用水等不同水質(zhì)水對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的影響，故進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，以便得出在溶血試驗(yàn)中溶血效果更好的陽(yáng)性對(duì)照。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

單列二孔恒溫水溫鍋，型號(hào) DZKEW-C，上海樹(shù)立儀器儀表有限公司;臺(tái)式低速大容量離心機(jī)，型號(hào)TDL-5型，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng);紫外分光光度計(jì)，型號(hào) UV2201型，日本島津公司;自動(dòng)雙重純水蒸餾器，型號(hào)SZ-93A，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

1.1.2 動(dòng)物

新西蘭兔，體重2.5Kg左右，雌雄不限，由濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(魯)20100005】。取血在本中心普通環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)【SYXK(魯)20100004】。

1.2 方法［2－5］

1.2.1 幾種水質(zhì)的準(zhǔn)備

滅菌注射用水:批號(hào)1208222購(gòu)自天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司;純凈水:批號(hào)20120331購(gòu)自娃哈哈集團(tuán)有限公司;雙蒸水:本中心采用自動(dòng)雙重純水蒸餾器制備;去離子水:由濟(jì)南誠(chéng)言經(jīng)貿(mào)有限公司提供;純水:本中心采用動(dòng)物飲用純水處理器制備。

1.2.2 2%紅細(xì)胞懸液制備

采用家兔心臟取血方法，取血約10 mL。將血液迅速置燒杯中，用竹簽攪拌去除纖維蛋白原，使成脫纖血液。加入約10倍量的0.9%氯化鈉注射液，混勻后離心15 min(1500 r/min)，去除上清液，再加入0.9%氯化鈉注射液按上述方法反復(fù)洗滌2～3次，至上層液體不顯紅色為止。將所得紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉注射液稀釋成2%(V/V)的混懸液備用。

1.2.3 溶血試驗(yàn)

取潔凈試管7支，進(jìn)行編號(hào)，1～7號(hào)管為不同水質(zhì)管，分別為純水、雙蒸水、滅菌注射用水、去離子水、純凈水、飲用水、0.9%氯化鈉注射液。按表1所示依次加入2%紅細(xì)胞混懸液、0.9%氯化鈉注射液或各種水質(zhì)，每個(gè)編號(hào)設(shè)3個(gè)平行管將各管輕輕搖勻，立即置恒溫水浴鍋中(37±0.5)℃保溫3 h。

1.2.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4.1 常規(guī)溶血試驗(yàn)體外試管法(肉眼觀察法)

若試管底無(wú)細(xì)胞殘留或有少量紅細(xì)胞殘留，溶液呈澄明紅色，表示完全溶血，記為“+”;若試管中紅細(xì)胞逐漸下沉，上層液體無(wú)色澄明或藥物顏色澄明，表明無(wú)溶血發(fā)生，記為“-”;若試管中紅細(xì)胞逐漸下沉，試管底有大量紅細(xì)胞殘留，溶液呈澄明紅色，表示部分溶血，記為“±”。若溶液中有棕紅色或或紅棕色絮狀沉淀，振搖試管后絮狀沉淀不分散，或用滴管吸取凝聚的絮狀物滴在載玻片上，在凝聚物邊緣滴加2滴0.9%氯化鈉注射液，置顯微鏡下觀察，凝聚物不被沖散者為真凝聚，記為“+”;若溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖試管后絮狀沉淀均勻分散開(kāi)，或用滴管吸取凝聚的絮狀物滴在載玻片上，在凝聚物邊緣滴加2滴0.9%氯化鈉注射液，置顯微鏡下觀察，凝聚物能被沖散者為假凝聚，記為“-”。

1.2.4.2 改進(jìn)的體外溶血試驗(yàn)法(分光光度法)

恒溫水浴鍋37℃溫孵3 h，離心15 min(1500 r/min)，每管取上清3 mL于石英杯中，用分光光度計(jì)測(cè)定。0.9%氯化鈉注射液調(diào)零后，于545 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管上清液吸收度。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理法

采用DAS1.0軟件對(duì)各管的吸光度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以表示。

2 結(jié)果

2.1 體外溶血肉眼觀察

將不同水質(zhì)水與2%兔血紅細(xì)胞混合，通過(guò)肉眼觀察其溶血程度。結(jié)果見(jiàn)表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，純水、雙蒸水、滅菌注射用水、去離子水、純凈水、飲用水等幾種不同水質(zhì)水均有溶血現(xiàn)象發(fā)生，但是溶血程度不同。純水、雙蒸水、滅菌注射用水、去離子水、純凈水等5種水質(zhì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肉眼觀察并無(wú)差異，上清均為澄明紅色，而飲用水隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，紅細(xì)胞破裂較少，大量紅細(xì)胞下沉，上清為澄明淡黃色。顯微鏡下觀察，飲用水管紅細(xì)胞數(shù)量明顯多于其它各管，各管均未見(jiàn)紅細(xì)胞凝聚。各管經(jīng)振搖后可見(jiàn)紅細(xì)胞均勻散開(kāi)，證明無(wú)紅細(xì)胞凝聚。

表1 體外溶血試驗(yàn)加樣表Tab.1 Sample list of hemolysis test in vitro

表2 幾種不同水質(zhì)水的溶血作用(肉眼觀察法)Tab.2 Hemolysis of several character water(macroscopic observation methods)

2.2 體外溶血的吸光度比較

分別用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各管的吸光度，測(cè)定其對(duì)紅細(xì)胞的影響。結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，分光光度計(jì)法與肉眼觀測(cè)結(jié)果一致，溶血程度輕的飲用水管吸光度也小，其它各管吸光度也有差異。幾種水質(zhì)對(duì)兔血紅細(xì)胞的溶血程度為滅菌注射用水＞純凈水 ＞雙蒸水 ＞純水 ＞去離子水 ＞飲用水。

3 討論

天然水質(zhì)中通常含有很多雜質(zhì)，包括電解質(zhì)、有機(jī)物質(zhì)、顆粒物、微生物和溶解氣體等，生活中的飲用水其質(zhì)量必須符合國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)GB5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》。水的純化，就是指去掉這些雜質(zhì)，雜質(zhì)去除的越徹底，水也就越純凈。蒸餾

水與超純水，去離子水，其實(shí)都是純度非常高的水，水中的雜質(zhì)含量很少，一般電導(dǎo)率都在1us/cm以下，主要區(qū)別在于制作工藝的不同，以及有些雜質(zhì)含量有區(qū)分。去離子水的制備是飲用水完全或不完全地去除離子物質(zhì)，主要采用過(guò)RO膜和混床樹(shù)脂處理方法;蒸餾水的制備則是利用液體混合物中各組分揮發(fā)度的差別，使H2O汽化并隨之使蒸氣部分冷凝分離而得的水，雙蒸水是指將經(jīng)過(guò)一次蒸餾后的水，再次蒸餾所得到的水;純水也稱(chēng)RO水，是通過(guò)反滲透膜過(guò)濾后的水，反滲透膜的孔徑一般為10～100A之間，所以它能夠去除95%以上的離子態(tài)雜質(zhì);純凈水也稱(chēng)為雙級(jí)反滲透水、雙級(jí)RO水，娃哈哈純凈水采用美國(guó)二級(jí)反滲透技術(shù)，注射用水是純化水再次蒸餾得到，中國(guó)藥典則規(guī)定注射用水的生產(chǎn)工藝必須是蒸餾，可以分別以純化水、去離子水等為源水，制備得到符合標(biāo)準(zhǔn)的注射用水。按2010版中國(guó)藥典規(guī)定［6］，飲用水可作為藥材凈制時(shí)的漂洗、制藥用具的粗洗用水，純化水可作為配制普通的藥物制劑溶劑或試驗(yàn)用水，不得用于注射劑的配制與稀釋?zhuān)⑸溆盟勺鳛榕渲谱⑸鋭┯玫娜軇?，滅菌注射用水用于滅菌粉末的溶劑或注射液的稀釋劑。由此可?jiàn)，水的等級(jí)順序由低到高依次是是飲用水、去離子水、純水(RO水)、雙蒸水、純凈水(雙級(jí)反滲透水、雙級(jí)RO水)、滅菌注射用水。

對(duì)溶血試驗(yàn)操作報(bào)道的文獻(xiàn)較多，方法不盡相同，程大任等［7］就其不同的方法以及可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響的條件進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，動(dòng)脈或靜脈血用于試驗(yàn)對(duì)溶血結(jié)果沒(méi)有顯著影響，故本實(shí)驗(yàn)采用易于操作的心臟取血法。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明:滅菌注射用水、純凈水、雙蒸水、純水、去離子水、飲用水等幾種水質(zhì)，均能發(fā)生肉眼及顯微鏡下可見(jiàn)的溶血反應(yīng)，但同時(shí)也可以看到，不同水質(zhì)對(duì)家兔紅細(xì)胞的溶血反應(yīng)不盡相同。由試驗(yàn)結(jié)果可知，水的純度越大，所含離子越少，吸光度越高，溶血反應(yīng)越大。在溶血試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照推薦使用滅菌注射用水。

表3 幾種不同水質(zhì)水的溶血作用(分光光度法)(n=3)Tab.3 Hemolysis of several character water(spectrophotometry)

［1］化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則［S］.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，2005:25-27.

［2］沈放，楊黎江，彭永芳，等.重樓皂苷類(lèi)化合物溶血作用研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(9):2280-2281.

［3］鄧元榮，卓?jī)x榮，王玲.油茶皂苷的體外溶血試驗(yàn)研究［J］.海峽藥學(xué)，2008，20(12):9-32.

［4］張劍峰，項(xiàng)崢，竇德強(qiáng).血塞通注射液溶血檢測(cè)方法研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2011，13(1):34-38.

［5］袁伯俊，廖明陽(yáng)，李波.藥物毒理學(xué)試驗(yàn)方法與技術(shù)［M］.第1版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007:259-261.

［6］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄XVI.

［7］程大任，付銳，竇德強(qiáng).人參皂苷溶血及抗溶血作用研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2007，9(4):19-23.