隋 陽(yáng)， 郭影坤

（東北制藥集團(tuán)供銷有限公司， 遼寧 沈陽(yáng) 110023）

槲皮素(quercetin)是一種天然黃酮類化合物，其化學(xué)名為2-(3,4-二羥苯基)-3,5,7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。槲皮素?fù)?jù)報(bào)道還具有抑菌活性[1]但是槲皮素的水溶性差，很難應(yīng)用于臨床?？赏ㄟ^在槲皮素的結(jié)構(gòu)中引入親水性基團(tuán)，來增加其溶解性，以便其于吸收，從而增強(qiáng)其藥理作用。為增強(qiáng)其水溶性，現(xiàn)將槲皮素衍生化為3′-羧甲基槲皮素鈉（3′-CMQ-3Na）及 4′-羧甲基槲皮素鈉(4′-CMQ-3Na)，本論文主要考察這兩種水溶性槲皮素的抑菌活性。以便進(jìn)一步探究這兩種衍生物是否與槲皮素一樣，具有其他多種藥理活性，以便更好的開發(fā)、利用槲皮素，使其擁有更好的臨床應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

中間普氏菌、大腸桿菌O111、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC1.2465、金黃色葡萄球菌(Wright) ATCC 49525;、肺炎克雷伯菌。

1.1.2 供試液的配制

磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制：取8 g 氯化鈉，0.2 g 氯化鉀，2.9 g 十二水合磷酸氫二鈉、0.2 g 磷酸二氫鉀，加入1 000 mL 三蒸水。LB 液體培養(yǎng)基的配制：取10 g 氯化鈉，10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母粉，加入1 000 mL 三蒸水。LB 固體培養(yǎng)基的配制：于上述培養(yǎng)基加入1 000 mL 三蒸水前，加入16 g瓊脂粉，其余步驟相同。CDC 液體培養(yǎng)基的配制：取 5 g 氯化鈉，15 g 胰蛋白胨，5 g 酵母粉，5 g大豆蛋白胨，維生素 K 10 mL,，氯化血紅素 5 mg，400 mg L-半胱氨酸，加入1 000 mL 三蒸水。CDC固體培養(yǎng)基的配制：于上述培養(yǎng)基加入1 000 mL 三蒸水前，加入16 g 瓊脂粉，其余步驟相同。頭孢哌酮鈉溶液的配制：頭孢哌酮鈉粉針劑在每次用前現(xiàn)配。將10 mL 蒸餾水注入1 g 頭孢哌酮鈉中混勻，并用濾膜過濾兩次，藥物濃度為100 mg·mL-1。替硝唑溶液的配制：按說明書配制，并在使用前用濾膜過濾兩次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌活性

取100 μL 的菌種，接入到LB 培養(yǎng)基中，在37 ℃，160 r·min-1的條件下振搖 24 h。收集細(xì)菌，于 4 ℃，6 000 r·min-1條件下離心 10 min，然后棄上清，用PBS 重懸并集于一個(gè)EP 管內(nèi)。將菌液依次稀釋106、107、108、109 倍，分別涂到LB 固體培養(yǎng)板上，倒置于37℃保溫箱內(nèi)20 h,計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品量均為20 mL，將菌液加入到無菌的LB 液體培養(yǎng)基，并用此培養(yǎng)基將經(jīng)2 次濾膜過濾的3′-羧甲基槲皮素鈉及 4′-羧甲基槲皮素鈉進(jìn)行稀釋，調(diào)整 3′-羧甲基槲皮素鈉濃度至0.05, 0.025, 0.0125 , 0.00625 mg·mL-1，4′-羧甲基槲皮素鈉濃度至 0.2, 0.1 , 0.05 ,0.025 mg·mL-1。同時(shí)設(shè)置 20 mL 無菌的 LB 為空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液為陰性對(duì)照（-）；在加入了菌液的LB 中再加入新鮮配制的頭孢哌酮鈉溶液，使頭孢哌酮鈉的終濃度為 1 mg·mL-1，此20 mL母液作為陽(yáng)性對(duì)照（+）。菌液的終濃度均調(diào)整為107 cfu?mL-1。每隔4 h 用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)樣品的吸光值，波長(zhǎng)為600 nm，連續(xù)測(cè)2 h[2]。

1.2.2 對(duì)金黃色葡萄球菌(Wright)的抑菌活性

取100 μL 的菌種方法同前，調(diào)整兩化合物濃度均至 0.2, 0.1 , 0.05 , 0.025 mg?mL-1。同時(shí)設(shè)置 20 mL無菌的LB 為空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液為陰性對(duì)照（-）；在加入了菌液的 LB 中再加入新鮮配制的頭孢哌酮鈉溶液，使頭孢哌酮鈉的終濃度為1 mg?mL-1，此 20 mL 母液作為陽(yáng)性對(duì)照（+）。菌液的終濃度均調(diào)整為107 cfu·mL-1。每隔4 h 用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)樣品的吸光值，波長(zhǎng)為 600 nm,連續(xù)測(cè)24 h。

1.2.3 對(duì)肺炎克雷伯菌的抑菌活性

取100 μL 的菌種方法同前，調(diào)整兩化合物濃度均至 0.8, 0.4 , 0.2, 0.1 mg·mL-1。同時(shí)設(shè)置 20 mL 無菌的LB 為空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液為陰性對(duì)照（-）；在加入了菌液的 LB 中再加入新鮮配制的頭孢哌酮鈉溶液，使頭孢哌酮鈉的終濃度為 1 mg·mL-1，此 20 mL 母液作為陽(yáng)性對(duì)照（+）。菌液的終濃度均調(diào)整為107 cfu·mL-1。每隔4 h 用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)樣品的吸光值，波長(zhǎng)為 600 nm,連續(xù)測(cè)24 h。

1.2.4 對(duì)大腸桿菌的抑菌活性

取100 μL 的菌種方法同前，調(diào)整兩化合物濃度均至 1.6 , 0.8 , 0.4, 0.2 mg·mL-1。同時(shí)設(shè)置 20 mL 無菌的LB 為空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液為陰性對(duì)照（-）；在加入了菌液的 LB 中再加入新鮮配制的頭孢哌酮鈉溶液，使頭孢哌酮鈉的終濃度為 1 mg·mL-1，此 20 mL 母液作為陽(yáng)性對(duì)照（+）。菌液的終濃度均調(diào)整為107 cfu·mL-1。每隔4 h 用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)樣品的吸光值，波長(zhǎng)為 600 nm,連續(xù)測(cè)24 h。

1.2.5 對(duì)中間普氏菌的抑菌活性

在CDC 血平板上厭氧培養(yǎng)96 h，經(jīng)鑒定后將數(shù)個(gè)典型菌落混懸于CDC 液體培養(yǎng)基，于CDC 液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)48 h，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。用無菌的CDC 液體培養(yǎng)基對(duì)經(jīng)2 次濾膜過濾的3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉進(jìn)行稀釋，再加中間普氏菌菌液，調(diào)整 3′-羧甲基槲皮素鈉及 4′-羧甲基槲皮素鈉終濃度均為 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 mg?mL-1。同時(shí)設(shè)置無菌的CDC 為空白；加入了菌液的 CDC 母液為陰性對(duì)照（-）；在加入了菌液的CDC 中再加入配制好的替硝唑溶液，使替硝唑的終濃度為 1 mg?mL-1，此母液作為陽(yáng)性對(duì)照（+）。菌液的終濃度均調(diào)整為 107 cfu?mL-1。將青霉素小瓶于37℃、厭氧培養(yǎng)，每隔6 h 用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)樣品的吸光值，波長(zhǎng)為620 nm，連續(xù)測(cè)36 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)。3′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）為0.05 mg?mL-1，抑菌率（BIR）[3]為98.8%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)。4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的 MIC 為0.05 mg?mL-1，BIR 為92.4%，抑菌效果良好。

2.2 對(duì)金黃色葡萄球菌(Wright)的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)。3′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 為0.1 mg?mL-1，BIR 為87.3%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)。4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 為0.1 mg?mL-1，BIR 為78.6%，抑菌效果良好。

2.3 對(duì)肺炎克雷伯菌的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)肺炎克雷伯菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)。3′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)肺炎克雷伯菌的 MIC 為 0.8 mg?mL-1，BIR 為83.9%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)肺炎克雷伯菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)。4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)肺炎克雷伯菌的 MIC 為 0.8 mg?mL-1，BIR 為 87.5%，抑菌效果良好。

2.4 對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)。3′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)大腸桿菌的MIC 為1.6 mg?mL-1，BIR為100%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)。4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)大腸桿菌的MIC 為1.6 mg?mL-1，BIR為97.9%，抑菌效果良好。

2.5 對(duì)中間普氏菌的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素三對(duì)中間普氏菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)。3′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)中間普氏菌的 MIC 為 0.05 mg?mL-1，BIR 為100%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)中間普氏菌的抑菌效果。隨著藥物濃度的增加，抑菌活性逐漸增強(qiáng)。4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)中間普氏菌的 MIC 為 0.05 mg?mL-1， BIR 為 99.8%，抑菌效果良好。

2.6 3′-羧甲基槲皮素鈉及 4′-羧甲基槲皮素鈉的抑菌活性比較

3′-羧甲基槲皮素鈉及 4′-羧甲基槲皮素鈉的抑菌活性比較見表1 和圖1。

表1 3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉的抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of 3-carboxymethylquercetin and sodium 4′-carboxymethylquercetin

圖1 3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)不同細(xì)菌的最小抑菌濃度Fig.1 Minimal inhibitory concentrations of 3-carboxymethylquercetin and sodium 4′-carboxymethylquercetin for different bacteria

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黃色葡萄球菌(Wright)均為革蘭陽(yáng)性菌，兩種化合物對(duì)其抑菌作用明顯。肺炎克雷伯菌、大腸桿菌均為革蘭陰性菌，兩種化合物對(duì)其也具有抑菌作用，但沒有革蘭陽(yáng)性菌明顯。中間普氏菌也屬于革蘭陰性菌，同時(shí)又屬于厭氧菌，兩種化合物對(duì)其也具有明顯的抑菌作用。

通過抑菌率的比較進(jìn)一步說明了 3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉的抑菌作用良好，且對(duì)金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)的抑菌作用強(qiáng)于金黃色葡萄球菌(Wright)。同時(shí)對(duì)既屬于革蘭陰性菌，又屬于厭氧菌的中間普氏菌，也具有非常明顯的抑制作用見圖2。

圖2 3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉在對(duì)不同細(xì)菌的最小抑菌濃度下的抑菌率Fig.2 Bacterial inhibition rates of 3′-carboxymethylquercetin and sodium 4′-carboxymethylquercetin under the minimum inhibitory concentration for different bacteria

3 結(jié) 論

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黃色葡萄球菌(Wright)均為革蘭陽(yáng)性菌，大腸桿菌和肺炎克雷伯菌均為革蘭陰性菌，3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)革蘭陽(yáng)性菌抑菌作用明顯優(yōu)于革蘭陰性菌。并且金黃色葡萄球菌(Wright)比金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的最小抑菌濃度高一倍。這些也為深入研究其作用機(jī)制提供了方向。另外，同樣是革蘭陰性菌的大腸桿菌與肺炎克雷伯菌相比，最小抑菌濃度卻要大了一倍，原因可能是人體食用的植物性食物中含有槲皮素，經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化，人體內(nèi)大腸桿菌對(duì)槲皮素可能產(chǎn)生了耐藥性，而且大腸桿菌確實(shí)存在耐藥性[4]。另外，肺炎克雷伯菌也具有一定的耐藥性[5]，尤其與其他細(xì)菌相比，具有略高最小抑菌濃度的肺炎克雷伯菌是否對(duì)槲皮素也具有耐藥性仍有待考察。另外，從抑菌率中還發(fā)現(xiàn) 3′-羧甲基槲皮素鈉比 4′-羧甲基槲皮素鈉的抑菌效果略好。3′-羧甲基槲皮素鈉及4′-羧甲基槲皮素鈉對(duì)革蘭陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黃色葡萄球菌(Wright)，革蘭陰性菌如肺炎克雷伯菌、大腸桿菌，及其中的厭氧菌如中間普氏菌，均有良好的抑菌作用。結(jié)果揭示 3′-羧甲基槲皮素鈉及 4′-羧甲基槲皮素鈉與槲皮素具有類似的抗菌活性，這為進(jìn)一步探究水溶性槲皮素衍生物的藥理活性提供了可能，也為日后臨床開發(fā)槲皮素奠定了一定的基礎(chǔ)。

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