王忠喬，楊軒，岳才軍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

薄層層析（TLC）是50年代以后發(fā)展起來的一種分離、分析方法，是一種與柱層析原理相近的分析方法。兼具鑒定分離雙重特性、結(jié)果直觀、操作快捷、設(shè)備簡單、花費小等一系列優(yōu)點，使其成為藥學(xué)尤其是中藥學(xué)研究中最常用的分析手段[1-3]。同時薄層層析的結(jié)果對高效液相色譜（HPLC）等分析方法具有重要的借鑒意義。使其在化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等方面快速的發(fā)展。

人參皂苷作為人參中最重要的活性成分一直備受關(guān)注，人參皂苷具有抗疲勞，調(diào)節(jié)神經(jīng)，抗癌等多種重要的作用[4]。傳統(tǒng)栽培已完全無法滿足市場和研究的需求，如何大量生產(chǎn)人參皂苷和轉(zhuǎn)化稀有皂苷成為現(xiàn)階段研究的重點，同時快速檢測和分離人參皂苷、皂苷類似化合物及皂苷前體物質(zhì)的技術(shù)也成為熱點之一。酵母菌株（Y828-15-1），是實驗室保藏的一株通過分子手段構(gòu)建、篩選的能產(chǎn)生皂苷類似物的優(yōu)良菌株。通過人參基因組轉(zhuǎn)染釀酒酵母，使釀酒酵母表達(dá)人參皂苷合成所需的前體物質(zhì)及酶類，改變釀酒酵母代謝途徑，使其能夠產(chǎn)生皂苷類似化合物。

自80年代人參研究進(jìn)入精密實驗階段以來，薄層層析一直是鑒定和分離人參皂苷的重要方法。已有報道的人參抽提物展開系統(tǒng)有幾十種，都能對人參皂苷進(jìn)行不同程度的分離。但對分離酵母生產(chǎn)皂苷類化合物的展開系統(tǒng)還沒有被報道過。實驗選取了較常用的5 種人參抽提物層析展開系統(tǒng)與實驗室優(yōu)化的對Y828-15-1 抽提物展開系統(tǒng)進(jìn)行對比，以期找到適合的TLC 方法，加快對酵母生產(chǎn)的皂苷類似產(chǎn)物的鑒定和分離速度。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品（購于吉林中醫(yī)藥大學(xué)），薄層層析板（青島海洋，G 硅膠，10 cm ×20 cm），展開劑所需有機溶劑（分析純），微量注射器，層析缸，超聲破碎儀，恒溫水浴鍋，恒溫?fù)u床。

1.2 樣品的制備

取預(yù)存在50%甘油中的酵母菌涂布在YPD 平板上活化24 h。挑取單菌落接入裝有5 mL YPD 培養(yǎng)基的試管中，置于恒溫?fù)u床中30 ℃160 r 培養(yǎng)8 h。離心收集菌體，并用無菌水清洗兩次。將收集的菌體置于2 mL EP 管中。在EP 管中緩緩加入1 mL 甲醇，超聲破碎5 min。60 ℃水浴加熱24 h，水浴過程中多次震蕩，使提取完全。離心取上清，移入新的EP 管中。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

精確稱取人參皂標(biāo)準(zhǔn)品粉末10 mg，甲醇定容至10 mL。即為濃度為1 mg·mL-1的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.4 薄層層析

1.4.1 點樣

在活化后的成品G 硅膠薄層層析板邊緣1.5 cm處劃一條橫線，作為起點線。在起點線上等距離取數(shù)個點樣點。點樣點間距及到層析板邊緣距離應(yīng)不小于1 cm。用微量注射器將制備好的樣品及人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品點在點樣點上。點樣斑點不宜過大，應(yīng)保持在直徑2 mm 之內(nèi)，同時點樣量不宜過多，以免造成拖尾。

1.4.2 展開劑

選擇了2005 版國家藥典及以報道過的常用人參皂苷展開系統(tǒng)5 種，實驗室參考PRISMA 模型優(yōu)化理論優(yōu)化展開系統(tǒng)1 種，如表1：

S1：最廣泛使用的人參皂苷鑒定用TLC 展開系統(tǒng)

S2、S3：2001年周漩等優(yōu)化的分離人參皂甙用TLC 展開系統(tǒng)[5]

S4：實驗室優(yōu)化的Y828-15-1 菌株抽提物用TLC展開系統(tǒng)

S5：《中華人民共和國藥典》（一部）2005 版推薦的人參鑒定用TLC 展開系統(tǒng)[6]

S6：一種分離人參皂苷Rb1 和Rg1 用TLC 展開系統(tǒng)[7]

表1 展開劑配比方法和結(jié)果Table 1 The ingredients of developer and the results of experiment

1.4.3 展開

將展開劑按所需比例混合，10 ℃靜置4 h。吸取展開劑和點好樣品的層析板放置到層析缸中飽和1 h后進(jìn)行展開。展開劑的高度以沒過層析板8～10 cm為適宜。封閉層析缸后展開劑上行12～15 cm 后取出硅膠板，室溫自然揮干。

1.4.4 顯色

飽和碘蒸汽顯色至斑點清晰可見，顯色時間不宜過長。

2 結(jié)果和分析

2.1 結(jié)果

展開系統(tǒng)S1 結(jié)果如圖1 所示，在Rf=0.8～0.85間可以看到3 個清晰的斑點標(biāo)記為a，b，c，Rf=0～0.6間有一系列不明顯的斑點。2 號展開系統(tǒng)結(jié)果如圖2所示，在Rf=0.35～0.45 間有2 個清晰的斑點d，e。3號展開系統(tǒng)如圖3 所示，在Rf=0.3～0.5 間有兩個清晰的斑點g，h。菌株Y828-15-1 在Rf=0.7 處顯示了一個與其他組完全不同的清晰斑點，標(biāo)記為f。4 號展開系統(tǒng)如圖4 所示，在Rf=0.6 處有一個清晰的斑點i，菌株Y828-15-1 在Rf=0.4 和Rf=0.5 處有兩個斑點標(biāo)記為g，h。5 號展開系統(tǒng)和6 號展開系統(tǒng)無法良好的展開樣品，在層析板上無法獲得清晰的斑點（結(jié)果未列出）。

圖1 S1 展開系統(tǒng)結(jié)果Fig.1 Result of S1 TLC solvent system

圖2 S2 展開系統(tǒng)結(jié)果Fig.2 Result of S2 TLC solvent system

圖3 S3 展開系統(tǒng)結(jié)果Fig.3 Result of S3 TLC solvent system

圖4 S4 展開系統(tǒng)結(jié)果Fig.4 Result of S4 TLC solvent system

2.2 分析

S1 結(jié)果中有一系列不明顯的斑點，預(yù)示著可能存在著多種未被完全分離的物質(zhì)。S3 系統(tǒng)比S1、S2和S4 多加了正丁醇，結(jié)果顯示正丁醇對皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的Rf 改變沒有明顯的作用，對酵母提取物的分離起到一定的作用。但加入正丁醇后，展開劑粘度增加，展開速度明顯降低，不利于快速鑒定和大量分離。S5系統(tǒng)中加入對人參皂苷Rg1 和Rg2 分離起關(guān)鍵作用的乙酸乙酯，兩種酵母提取物和人參皂苷Rb1 標(biāo)準(zhǔn)品均無法分離，人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rh2 在Rf=0.9 處有斑點。S6 系統(tǒng)對所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均無法分離。

S1～S5 結(jié)果表明，甲醇和水的飽和程度對酵母抽提物薄層分離起著關(guān)鍵性的作用，但這種作用是極端敏感的，少量的改變易造成巨大的差異。酵母真核表達(dá)過程可能對產(chǎn)物進(jìn)行一些極性化修飾，造成新產(chǎn)物極性過大，對檢測造成不良影響。對甲醇和水的飽和程度的調(diào)節(jié)可以對展開劑極性進(jìn)行調(diào)節(jié)，快速檢測這種極性的改變。試驗表明，甲醇與水的飽和度應(yīng)取∶氯仿∶甲醇∶水=130∶70∶X（12

3 討論

實驗確定實驗組S4 具有分離快速，能分離組分多，組分簡單等優(yōu)點，實驗操作性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其他組分，對酵母工程菌株Y828-15-1 提取物是一種優(yōu)良的展開系統(tǒng)。對未明確產(chǎn)物f、j、k 還需進(jìn)一步分析，可以通過高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜、核磁共振等方法對其進(jìn)行精確的分析[8]。

［1］楊發(fā)申.薄層層析中展開劑的選擇［J］.浙江化工，1992，23（1）：55-57.

［2］曹洪玉.薄層層析法對藥物成分的剖析［J］.赤峰學(xué)院學(xué)報，2009，25（12）：31-34.

［3］楊文志，婁子恒，潘曉鵬，等.薄層色譜法在生藥分析中的作用［J］.人參研究，2006（2）：25-26.

［4］郭秀麗，高淑蓮.人參化學(xué)成分和藥理研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)臨床研究，2012（4）：26-27.

［5］周漩，林樂明，張軍.薄層色譜法分離人參皂苷的展開劑優(yōu)化［J］.中國臨床醫(yī)學(xué)雜志，2001，21（6）：61-62.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［7］劉劍娜，朱靖博，閆海全，等.三七總皂苷中Rg1 和Rb1的分離純化［J］.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，29：18-20.

［8］安紅波，阮洪生，張爽，等.HPLC 法測定光療藥物竹紅菌乙素的含量［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2009，21（3）：70-72.