楊 敏，梁 琪，楊繼濤，張 媛

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅蘭州730070;2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

牦牛是青藏高原特有的優(yōu)勢畜種，長期生活在海拔3000m 以上無污染的高寒草原，牦牛乳是不折不扣的天然綠色食品，也是青藏高原地區(qū)牧民最主要的生活物資來源。近年來，世界牦牛乳年產(chǎn)量已增加至4000 萬t，使得這一獨(dú)特資源越來越受到眾多學(xué)者的關(guān)注［1-4］。牛乳經(jīng)脫脂、酸沉淀、脫水、干燥后制成粉末狀制品即為酪蛋白，又稱干酪素。酪蛋白及其制品有著較高的營養(yǎng)價(jià)值和良好的功能特性，適合作為乳化劑、增稠劑和營養(yǎng)強(qiáng)化劑等，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)［1，5］。甘肅省是全國最大的酪蛋白生產(chǎn)基地，有酪蛋白生產(chǎn)企業(yè)12 家，均以牦牛乳為原料，年產(chǎn)牦牛乳酪蛋白1.35 萬t 以上，占全國酪蛋白總產(chǎn)量的90%以上。蛋白質(zhì)的酰胺化作用具有顯著改變蛋白質(zhì)的凈電荷，從而改善其乳化性、溶解性、凝膠性等功能特性的作用［6-7］。琥珀酸酐具有低毒、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，是蛋白質(zhì)改性用的主要?；噭?，其反應(yīng)原理如圖1 所示。琥珀?；揎棽粌H可以增加酪蛋白膠束的凈負(fù)電荷，還能顯著提高其乳化性能［8］。

圖1 蛋白質(zhì)琥珀?；磻?yīng)原理Fig.1 Succinylation reaction principle of protein

為了提高牦牛乳酪蛋白的功能特性，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，本研究以琥珀酸酐為酰化試劑，以牦牛乳酪蛋白為原料，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了?；に?，獲得了最佳?；瘲l件，并測定了修飾酪蛋白的乳化特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛乳酪蛋白 由甘肅華羚生物科技有限公司提供，其中酪蛋白含量為94.20%，水分含量為3.12%;乙醇、丁二酸酐、琥珀酸酐 天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司;氫氧化鈉 天津市化學(xué)試劑三廠;鹽酸 天津市化學(xué)試劑三廠;十二烷基磺酸鈉 天津市福晨化學(xué)試劑廠。

UV-2100 雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京北分瑞利分析儀器(集團(tuán))有限責(zé)任公司;精密電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市順化儀器有限公司;PHS-3C-01 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì) 上海三信儀表廠;立式高速冷凍離心機(jī)(KR25i) 法國Jouan 公司;XHF-D 型內(nèi)切式勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛乳酪蛋白溶解 準(zhǔn)確稱取1.0000g 牦牛乳酪蛋白，加入100mL 去離子水中，在40℃磁力攪拌下并用1.0mol·L-1NaOH 溶液不斷調(diào)節(jié)pH 使其穩(wěn)定在7.0 直至酪蛋白完全溶解，備用。

1.2.2 牦牛乳酪蛋白琥珀?；に噧?yōu)化

1.2.2.1 酪蛋白與琥珀酸酐配比的選擇 設(shè)定琥珀酸酐:酪蛋白(g/g)分別為0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1、1.0∶1，采用2.0mol/L 和1.0mol·L-1的NaOH 溶液調(diào)節(jié)酪蛋白溶液pH 至8.0，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為50min，在磁力攪拌下分多次加入琥珀酸酐，并保持溶液pH 穩(wěn)定在8.0，反應(yīng)結(jié)束后將溶液定容至250mL，考察酪蛋白的?；潭?，每個(gè)水平重復(fù)三次，下同。

1.2.2.2 ?；痯H 的選擇 將反應(yīng)pH 分別設(shè)定為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，采用優(yōu)化后的最佳配比，其他反應(yīng)條件同1.2.2.1，考察酪蛋白的?；潭?。

1.2.2.3 酰化溫度的選擇 設(shè)定反應(yīng)溫度為30、40、50、60、70、80℃，采用優(yōu)化后的最佳配比和pH，反應(yīng)時(shí)間為50min，考察酪蛋白的?；潭取?/p>

1.2.2.4 ?；瘯r(shí)間的選擇 設(shè)定反應(yīng)時(shí)間分別為30、40、50、60、70、80min，采用優(yōu)化后的最佳配比、pH 和反應(yīng)溫度，考察酪蛋白的?；潭?。

1.2.3 ?；潭鹊臏y定 酪蛋白?；潭炔捎密崛壬y定，參照賈俊強(qiáng)等的方法并進(jìn)行修改［9-10］。

茚三酮比色法:移取酪蛋白溶液1.00mL，加入2%(w/v)茚三酮溶液1.00mL，混合液于沸水浴中加熱5min，迅速冷至室溫，加入5.00mL 蒸餾水，在580nm 波長下測定溶液的吸光度，蒸餾水做參比液。

式中:Y 為酰化程度，%;a 為未?；鞍兹芤旱奈舛?b 為酰化蛋白溶液的吸光度。

1.2.4 酰化酪蛋白的制備 用1.0mol·L-1HCl 溶液將?；罄业鞍兹芤簆H 調(diào)至等電點(diǎn)，于3500 ×g 離心15min，棄去上清液，將沉淀置于鋼制托盤進(jìn)行冷凍干燥，溫度為-50℃，壓強(qiáng)為500 ～600Pa，時(shí)間為24h，得到白色粉末狀?；业鞍字破?，備用。

1.2.5 乳化性的測定 取6.00mL 濃度為2mg/mL 的?；业鞍兹芤?溶解方法同1.2.1)與2.00mL 一級(jí)精煉大豆油混合于試管中，于20000r/min 均質(zhì)1min，分別在0min 和靜置10min 時(shí)從距離試管底部0.5cm 處取50μL 乳液并與5mL 質(zhì)量濃度為1g/L 的SDS 溶液混勻，以濃度為1g/L SDS 溶液做參比，于500nm 處測定吸光度［11］。

乳化活性指數(shù)(EAI)及乳化穩(wěn)定性指數(shù)ESI 的計(jì)算公式如下:

式中，C 為乳化前酪蛋白溶液的濃度，g/mL;D 為稀釋倍數(shù)，100;Φ 為乳液中油相的體積分?jǐn)?shù)，0.25;A0為乳液靜置0min 的吸光度;A10為乳液靜置10min 的吸光度。

1.2.6 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 考慮到琥珀酸酐用量增大致使?；潭仍黾又饕谟诜磻?yīng)物濃度增加使反應(yīng)程度增大，與反應(yīng)條件交互作用不大，因此固定琥珀酸酐與酪蛋白的配比，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)三因素三水平共17 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，其中析因部分實(shí)驗(yàn)次數(shù)為12 次，中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)為5 次，用以估算實(shí)驗(yàn)誤差。響應(yīng)曲面因子及水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)均為3 次實(shí)驗(yàn)的平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;利用Design Expert 8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，采用Origin 8.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酪蛋白與琥珀酸酐配比的選擇 琥珀酸酐與酪蛋白的配比對(duì)?；潭鹊挠绊懭鐖D2 所示。

圖2 琥珀酸酐與酪蛋白配比對(duì)?；潭鹊挠绊慒ig.2 Effect of succinic anhydride-casein ratio on the modified degree

由圖2 可以看出，酰化程度隨琥珀酸酐用量的增加而增大。當(dāng)琥珀酸酐與酪蛋白質(zhì)量比為0.6 ∶1時(shí)，?；潭葹?4.75%，當(dāng)配比為0.8∶1 時(shí)，?；潭葹?5.45%，較配比為0.6∶1 時(shí)雖然有所增加，但是增大幅度較小，僅增加了0.82%，且差異不顯著(p ＞0.05)。由此可見，隨著琥珀酸酐用量的增加，?；潭仍龃?，這是因?yàn)榉磻?yīng)物濃度增大致使化學(xué)反應(yīng)程度增加。但是當(dāng)配比達(dá)到0.6∶1 后，?；潭仍黾臃葮O小，此時(shí)游離氨基已經(jīng)基本反應(yīng)完全，剩余的少量氨基可能被緊密包埋于酪蛋白膠束內(nèi)部，由于位阻效應(yīng)無法完成?；磻?yīng)，因此，繼續(xù)增大琥珀酸酐用量，酰化程度增大幅度較小。綜合考慮?；潭燃霸铣杀荆晁狒c酪蛋白質(zhì)量比為0.6∶1 為最佳配比。

2.1.2 ?；痯H 的選擇 反應(yīng)pH 對(duì)?；潭鹊挠绊懭鐖D3 所示。

圖3 反應(yīng)pH 對(duì)?；潭鹊挠绊慒ig.3 Effect of pH on the modified degree

由圖3 可以看出，反應(yīng)體系pH 在堿性條件下酪蛋白?；潭容^高，pH 為8.0 ～10.0 時(shí)?；潭容^高，這是弱堿性條件利于酰胺化反應(yīng)。隨著pH 的增大，酪蛋白單體帶上負(fù)電荷，單體間靜電斥力增大，膠束的解離作用增強(qiáng)，單體解離程度增大［12-15］，游離氨基裸露程度增加，利于酰胺化反應(yīng)。但是，堿性過強(qiáng)時(shí)，琥珀酸酐水解后被大量堿中和，使體系中琥珀酸酐濃度迅速降低，?；潭蕊@著降低。本實(shí)驗(yàn)選擇9.0 為最佳反應(yīng)pH。

2.1.3 ?；瘻囟鹊倪x擇 反應(yīng)溫度對(duì)酰化程度的影響如圖4 所示。

由圖4 可以看出，反應(yīng)溫度為40～50℃時(shí)?；潭茸罡摺囟冗^低，琥珀酸酐水解速率較慢，?；磻?yīng)速率也較慢，?；潭容^低。當(dāng)溫度過高時(shí)，琥珀酸酐水解迅速，水解產(chǎn)生的酸易促使酪蛋白沉淀，不利于?；磻?yīng);另一方面，酪蛋白膠束在高溫加熱時(shí)易于聚集［16-17］，從而使?；潭冉档?。考慮到能耗成本，選擇40℃為最佳反應(yīng)溫度。

2.1.4 酰化時(shí)間的選擇 反應(yīng)時(shí)間對(duì)?；潭鹊挠绊懭鐖D5 所示。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)?；潭鹊挠绊慒ig.4 Effect of temperature on the acylation degree

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酰化程度的影響Fig.5 Effect of reaction time on the acylation degree

由圖5 可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為50min 時(shí)，酪蛋白?；潭茸罡摺ｋS著時(shí)間的延長，酪蛋白膠束在長時(shí)間熱處理下發(fā)生聚集［16-17］，致使部分氨基被包埋于膠束內(nèi)部，由于位阻效應(yīng)無法酰胺化，酪蛋白?；潭冉档?。由此可見，酰化反應(yīng)時(shí)間為50min 即可。

2.2 牦牛乳酪蛋白琥珀?；瘲l件的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of RSM

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Result of regression and variance analysis

2.2.2 擬合模型的建立及顯著性分析 利用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到牦牛乳酪蛋白琥珀酰化程度對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH 的實(shí)際值全變量二次多項(xiàng)回歸模型方程為:

在三種因素中，溫度對(duì)?；潭扔绊懽畲?，時(shí)間的影響最小。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析及優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)回歸分析結(jié)果得出當(dāng)琥珀酸酐與酪蛋白配比固定為0.6∶1 時(shí)，A、B、C 及各因素之間的交互作用對(duì)酪蛋白?；潭鹊挠绊懭鐖D6 所示。

從圖6a 可以看出，固定pH 為9.0，隨著溫度的升高，?；潭认仍黾?，后減小，溫度對(duì)酰化程度的影響較明顯。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，?；潭仍龃蠓融呌谄骄徤踔劣兴档停梢姴糠掷业鞍自跓崽幚硐码S著處理時(shí)間的延長聚集程度增大，游離氨基包埋量增加，酰化程度有所降低。當(dāng)溫度約為42℃、時(shí)間約為50min 時(shí)，?；潭冗_(dá)到最大。等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明時(shí)間與溫度的交互作用對(duì)?；潭扔绊戄^大。由圖6b 可以看出，反應(yīng)時(shí)間固定為50min 時(shí)，pH 對(duì)?；潭鹊挠绊懗尸F(xiàn)先增大后降低的趨勢，在弱堿性環(huán)境中?；潭容^大。隨著溫度的升高，等高線密度增大，隨著pH 的增大，等高線密度基本不變，說明溫度對(duì)?；潭鹊挠绊懘笥趐H。由圖6c 可以看出，pH 與時(shí)間交互作用的等高線基本呈現(xiàn)圓形，說明交互作用對(duì)?；潭扔绊懖伙@著。

圖6 各因素及交互作用對(duì)酰化程度的影響Fig.6 Response surface of factors and interactions on the degree of acylation

利用響應(yīng)面尋優(yōu)分析方法對(duì)回歸模型進(jìn)行分析可知，當(dāng)琥珀酸酐與酪蛋白配比為0.6，反應(yīng)溫度為41.92℃，反應(yīng)時(shí)間為49.20min，pH 為8.84 時(shí)，響應(yīng)面有最優(yōu)值，為86.32% ±0.97%。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，又考慮到實(shí)際操作的便利，將最優(yōu)條件修正為:反應(yīng)溫度為42℃，反應(yīng)時(shí)間為49min，pH 為8.8，在修正后的優(yōu)化反應(yīng)條件下，酪蛋白的琥珀?；潭葹?6.01% ±0.33%。

2.3 牦牛乳?；业鞍兹榛苑治?/h3>

牦牛乳酪蛋白在琥珀酰化修飾前后的乳化特性見表4。

表4 牦牛乳酪蛋白及琥珀?；业鞍兹榛€(wěn)定性和乳化活性Table 4 EAI and ESI values of modified yak caseins and unmodified yak casein

由表4 可以看出，琥珀?；揎楋@著改善了牦牛乳酪蛋白的乳化特性(p ＜0.01)。與未酰化酪蛋白相比，?；业鞍兹榛€(wěn)定性增加了161.64%，乳化活性增加了98.54%。眾所周知，蛋白質(zhì)的乳化性與其結(jié)構(gòu)密不可分，其親水區(qū)域與水相互作用，疏水區(qū)域與油相互作用，從而體現(xiàn)出一定的乳化特性。琥珀?；揎楋@著增加了酪蛋白的凈負(fù)電荷，使得膠束結(jié)構(gòu)伸展［8］。牛乳酪蛋白具有特殊的結(jié)構(gòu)，其單體肽鏈?zhǔn)杷詤^(qū)域與親水性區(qū)域完全分離，分子本身具有一定的疏水性［18-19］。在琥珀?；揎椬饔孟拢坞x氨基形成了親水性更強(qiáng)的琥珀酰胺基，使得酪蛋白肽鏈的親水性區(qū)域的親水性增強(qiáng)，從而減緩了乳濁液中油水兩相的分離、聚集和分層的速率。因此，琥珀酰化修飾顯著改善了酪蛋白的乳化性。

3 結(jié)論

對(duì)牦牛乳酪蛋白進(jìn)行了琥珀酰化修飾，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了?；に?，得出最佳反應(yīng)條件為溫度42℃，反應(yīng)時(shí)間49min，pH8.8;在最優(yōu)條件下，牦牛乳酪蛋白的琥珀酰化程度約86.01%。酪蛋白琥珀?；磻?yīng)條件溫和，參數(shù)可調(diào)范圍較大，易于調(diào)節(jié)和控制，?；揎棾潭雀?。

琥珀?；揎椩黾恿死业鞍啄z束的凈負(fù)電荷，使其結(jié)構(gòu)伸展，親水性增強(qiáng)，乳化穩(wěn)定性和乳化活性顯著改善，分別提高了161.64%和98.54%。因此，修飾酪蛋白可作為性能優(yōu)良的乳化劑。然而，琥珀酸酐雖然毒性較低，但其并非食品添加劑，琥珀?；揎椑业鞍啄芊裼糜谑称饭I(yè)還需對(duì)其食用安全性進(jìn)行評(píng)估。

［1］甘伯中，常海軍.余群力，等.牦牛曲拉干酪素脫色工藝優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2006，22(10) :203-207.

［2］余群力，甘伯中，敏文祥，等.牦?！扒本聘衫宜毓に囇芯浚跩］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2005，21(7) :140-144.

［3］Li H M，Ma Y，Dong A J，et al.Protein composition of yak milk.［J］.Dairy Science ＆ Technology，2009，90(1) :111-117.

［4］余群力，韓玲，蔣玉梅，等.白牦牛乳營養(yǎng)成分及風(fēng)味物質(zhì)分析［J］.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2005，27(4) :333-335.

［5］Braga A，Menossi M，Cunha R.The effect of the glucono-［delta］- lactone/caseinate ratio on sodium caseinate gelation［J］.International Dairy Journal，2006，16(5) :389-398.

［6］李磊，遲玉杰，王喜波，等.超聲-琥珀?；瘡?fù)合改性提高大豆分離蛋白乳化性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(3) :123-127.

［7］王喜波，遲玉杰，胥偉.超聲輔助琥珀酰化改性大豆蛋白研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42(5) :6-13.

［8］Vidal V，Marchesseau S，Lagaude A，et al. Influence of chemical agents on casein interactions in dairy products:chemical modification of milk proteins［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，1998，12:7-14.

［9］Paik W K，Kim S.Effect of methylation on susceptibility of protein to proteolytic enzymes［J］.Biochemistry，1972，11(14) :2589-2593.

［10］賈俊強(qiáng)，樂文俊，韓萌，等.乙?；男孕Q蛹蛋白條件的優(yōu)化［J］.食品科技，2011，36(3) :70-75.

［11］Jiang S J，Zhao X H.Transglutaminase-induced crosslinking and glucosamine conjugation of casein and some functional properties of the modified product［J］.International Dairy Journal，2011，21(4) :198-205.

［12］Liu Y，Guo R.pH-dependent structures and properties of casein micelles［J］.Biophysical Chemistry，2008，136:67-73.

［13］Raouche S，Marie D，Arjen B，et al.Stability of casein micelles subjected to CO2reversible acidification: Impact of carbonation temperature and chilled storage time［J］.International Dairy Journal，2008，18:221-227.

［14］Jaubert A，Durier C，Kobilinsky A，et al. Structural organization of the goat casein micelle: effect of the physicochemical environment( pH，temperature，ionic strength) on its mineral and protein composition［J］.International Dairy Journal，1999，9:369-370.

［15］Marchin S，Putaux J L，Pignon F，et al. Effects of the environmental factors on the casein micelle structure studied by cryotransmission electron microscopy and small- angle X- ray scattering/ultrasmall- angle X- ray scattering［J］.Journal of Chemical Physics，2007，126:45-51.

［16］Anema S G，Henning K.Heat-Induced，pH-Dependent Dissociation of Casein Micelles on Heating Reconstituted Skim Milk at Temperatures below 100℃［J］.Agricultural Food Chemistry，1997，45:1108-1115.

［17］Anema S G.Effect of Milk Concentration on Heat-Induced，pH - Dependent Dissociation of Casein from Micelles in Reconstituted Skim Milk at Temperatures between 20 and 120℃［J］.Agricultural Food Chemistry，1998，46:2299-2305.

［18］McMahon D J，Oommen B S.Supramolecular Structure of the Casein Micelle［J］.Journal of Dairy Science，2008，91 ( 5) :1709-1721.

［19］Euston S R，Horne D S.Simulating the self-association of caseins［J］.Food Hydrocolloids，2005，19(3) :379-386.