史正華，張劍寧

脂質(zhì)體阿霉素和熱療對腦膠質(zhì)瘤細胞的影響

史正華，張劍寧

目的探討脂質(zhì)體阿霉素和熱療對腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。方法體外培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細胞SWO-38，采用水浴加溫法，觀察單純熱療、阿霉素化療、脂質(zhì)體阿霉素化療、熱療+阿霉素化療、熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療對細胞增殖及凋亡的影響。MTT法確定阿霉素和脂質(zhì)體阿霉素的工作濃度并檢測細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。結(jié)果熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療組、熱療+阿霉素化療組的增殖抑制率分別為80.16%±3.78%、62.09%±3.05%，均顯著高于脂質(zhì)體阿霉素化療組(40.27%±2.32%)、阿霉素化療組(30.56%±2.03%)、單純熱療組(16.51%±1.26%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療組的增殖抑制率顯著高于熱療+阿霉素化療組(P＜0.05)。熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療組、熱療+阿霉素化療組的細胞凋亡率分別為84.19%±2.69%、60.29%±1.47%，均顯著高于脂質(zhì)體阿霉素化療組(46.72%±2.09%)、阿霉素化療組(35.09%±1.46%)、單純熱療組(17.85%±0.78%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療組的細胞凋亡率顯著高于熱療+阿霉素化療組(P＜0.05)。結(jié)論加熱可增強阿霉素及脂質(zhì)體阿霉素對人腦膠質(zhì)瘤細胞SWO-38的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，且對脂質(zhì)體阿霉素的增敏作用更強。

多柔比星；熱化療；細胞增殖；細胞凋亡

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)腫瘤，國內(nèi)資料統(tǒng)計占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的35.26%～60.96%，平均約為44.69%[1-2]?；熌苎娱L部分膠質(zhì)瘤患者的生存期，但效果欠佳。即使是相同病理類型和級別的膠質(zhì)瘤患者，治療效果仍存在很大差異，治療方法的不同無疑是重要影響因素，但腫瘤內(nèi)在的生物學(xué)特性，特別是分子水平的差異應(yīng)該是關(guān)鍵所在[1,3,4]。另外，血-腦脊液屏障的存在，也使腦膠質(zhì)瘤化療效果受到明顯影響。腫瘤熱療是繼手術(shù)、放療、化療、生物治療之后的一種新的腫瘤治療方法[5]。脂質(zhì)體(liposome)多用做運載藥物的載體[6]，但普通脂質(zhì)體進入體內(nèi)后可被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所捕獲，在血循環(huán)中存在的時間較短，因而不易到達腫瘤區(qū)域，使其應(yīng)用受到一定限制[7]。熱敏脂質(zhì)體(thermosensitive liposomes，TSL)是在脂質(zhì)體膜中加入一種熱敏性磷脂，在達到一定溫度時，脂質(zhì)體膜的狀態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致其通透性增加，使藥物大量釋放[8]，從而可明顯提高腫瘤組織內(nèi)的藥物濃度。本研究觀察熱療及脂質(zhì)體阿霉素對腦膠質(zhì)瘤細胞SWO-38的殺傷作用，并進一步探討其對SWO-38細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 注射用鹽酸阿霉素(adriamycin，ADM)、脂質(zhì)體阿霉素(liposomes-adriamycin，L-ADM)購自輝瑞制藥有限公司。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 人腦膠質(zhì)瘤SWO-38細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3～5d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞分為對照組、單純熱療組、阿霉素化療組、脂質(zhì)體阿霉素化療組、熱療+阿霉素化療組、熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療組，其中熱療時采用電熱恒溫水浴箱加熱，加熱溫度43℃，波動≤±0.1℃。

1.3 藥物工作濃度的確定 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期SWO-38細胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為5×104/ml，接種于50ml的培養(yǎng)瓶中，將細胞分為對照組、單純熱療組、阿霉素化療組、脂質(zhì)體阿霉素化療組、熱療+阿霉素化療組、熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療組，每組6個復(fù)孔，阿霉素及脂質(zhì)體阿霉素濃度均分別設(shè)為0、2、4、6、8、10、12、14、16mg/L。對照組及化療組放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，熱療組及熱療+化療組即刻放入電熱恒溫水浴箱中加熱相同時間(43℃ 1h)，然后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，以MTT法測定細胞增殖抑制率，以24h時間點的IC50作為實驗的工作濃度。

1.4 MTT法測定細胞增殖情況 取對數(shù)生長期的細胞，常規(guī)消化制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2.5×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μl， 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，按1.3所述處理細胞(每組設(shè)6個復(fù)孔)，每孔加入5g/L MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，取出培養(yǎng)板，棄去MTT液，每孔加入150μl DMSO，微量振蕩器上震蕩10min，然后將培養(yǎng)板置于全自動酶標儀上，在492nm波長處測定各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。實驗重復(fù)3次。細胞增殖抑制率(%)=(對照組A值一實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 每組收集5×105個細胞，用含2%牛血清白蛋白的PBS溶液洗滌2次，分別加入FITC標記的Annexin V和PI(操作按說明書進行)，避光放置1h，流式細胞儀檢測，每次讀取104個細胞。采用Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算細胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 阿霉素及脂質(zhì)體阿霉素工作濃度的確定 從圖1中可以看出，在相同濃度下，脂質(zhì)體阿霉素對腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制作用強于阿霉素。阿霉素IC50=8mg/L，脂質(zhì)體阿霉素IC50=4mg/L，將其分別作為阿霉素及脂質(zhì)體阿霉素的工作濃度。

圖1 不同濃度阿霉素、脂質(zhì)體阿霉素對SWO-38細胞增殖率的影響Fig.1 Influence of different concentration of ADM and L-ADM on proliferation of SWO-38 cells

2.2 各組細胞增殖抑制率比較 SWO-38細胞經(jīng)單純熱療、阿霉素化療、脂質(zhì)體阿霉素化療、熱療+阿霉素化療、熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療后，其增殖抑制率分別為16.51%±1.26%、30.56%±2.03%、40.27%±2.32%、62.09%±3.05%、80.16%±3.78%。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，熱療+阿霉素化療組、熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療組、阿霉素化療組、脂質(zhì)體阿霉素化療組的細胞增殖抑制率均明顯高于對照組(0%，P＜0.05)，且其余各組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 各組細胞凋亡率比較 SWO-38細胞經(jīng)單純熱療、阿霉素化療、脂質(zhì)體阿霉素化療、熱療+阿霉素化療、熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療后，其細胞凋亡率分別為17.85%±0.78%、35.09%±1.46%、46.72%±2.09%、60.29%±1.47%、84.19%±2.69%。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，熱療+阿霉素化療組、脂質(zhì)體阿霉素化療組、阿霉素化療組、熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療組細胞凋亡率均顯著高于對照組(2.31%±0.21%，P＜0.05)，且其余各組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

膠質(zhì)瘤是一類發(fā)病率高、危害性大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其典型臨床癥狀為顱內(nèi)壓增高及瘤周腦組織受壓表現(xiàn)[9]。目前膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)為主，放化療為輔，但傳統(tǒng)放化療缺乏特異性，在殺滅腫瘤細胞的同時也往往帶來明顯的毒副作用，而單純手術(shù)切除治療膠質(zhì)瘤的中位生存期僅為52周[10]，因此有必要尋找新的有效的治療手段。

阿霉素是臨床常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，然而該藥在殺傷腫瘤細胞的同時，也會產(chǎn)生明顯的全身不良反應(yīng)，如骨髓抑制、心臟損害等，因此臨床應(yīng)用受到限制。近年來出現(xiàn)的脂質(zhì)體阿霉素(liposome doxorubicin)既能加強藥物的抗癌作用，又能減少其毒副作用[11]。

熱敏脂質(zhì)體的膜組成成分中有對溫度敏感的物質(zhì)，當加熱到一定溫度時，脂質(zhì)體膜的狀態(tài)發(fā)生改變，通透性增加，使藥物大量釋放。阿霉素熱敏脂質(zhì)體在血液中循環(huán)時間長，能明顯降低肝臟和脾臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對阿霉素的吞噬量，當在腫瘤病變部位局部加熱時，可促使阿霉素在腫瘤局部大量釋放并高度濃集，從而顯著抑制腫瘤生長[12]。

從本文的研究結(jié)果可以看出：熱療+化療后SWO-38細胞的增殖抑制率顯著高于單純熱療、單純化療，且熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療組明顯高于熱療+阿霉素化療組。熱療+化療后SWO-38細胞的凋亡率顯著高于單純熱療、單純化療，且熱療+脂質(zhì)體阿霉素化療組明顯高于熱療+阿霉素化療組。該結(jié)果表明熱療與脂質(zhì)體阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對腦膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用更強，一方面療效得到明顯提高，另一方面也可降低阿霉素的用量，減少毒副反應(yīng)的發(fā)生。

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前單一療法尚不能獲得理想的治療效果，只有通過多學(xué)科的共同協(xié)作，以多種治療方法進行優(yōu)勢互補及有機聯(lián)合，才能到達理想的效果，但熱療與脂質(zhì)體阿霉素聯(lián)合應(yīng)用治療腦膠質(zhì)瘤的療效尚有待進一步臨床驗證。

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Effects of liposome-adriamycin (L-ADM) and thermotherapy on glioma cells: an experimental study

SHI Zheng-hua1, ZHANG Jian-ning2*
1Department of Neurosurgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China
2Department of Neurosurgery, Navy General Hospital, Beijing 100048, China
*

, E-mail: jnhang2005@yahoo.com.cn

ObjectiveTo observe the effects of liposome-adriamycin (L-ADM) and thermotherapy on proliferation and apoptosis of SWO-38 glioma cells.MethodsThe SWO-38 glioma cells were cultivated in vitro. The effects of thermotherapy (43℃), ADM chemotherapy, L-ADM chemotherapy, thermotherapy + ADM chemotherapy, and thermotherapy + L-ADM chemotherapy on the cell proliferation and apoptosis were observed. The working concentration of ADM and L-ADM, and the cell proliferation rate were determined by MTT method. The apoptotic rate was determined by flow cytometry.ResultsThe proliferation inhibition rate of thermotherapy + L-ADM chemotherapy and thermotherapy + ADM chemotherapy was 80.16%±3.78% and 62.09%±3.05%, respectively, and it was significantly higher than that of L-ADM chemotherapy (40.27%±2.32%), ADM chemotherapy (30.56%±2.03%) or thermotherapy (16.51%±1.26%, P＜0.05), and the proliferation inhibition rate of thermotherapy + L-ADM chemotherapy was higher than that of thermotherapy + ADM chemotherapy (P＜0.05). The apoptotic rate of thermotherapy + L-ADM chemotherapy and thermotherapy + ADM chemotherapy was 84.19%±2.69% and 60.29%±1.47%, respectively, and it was significantly higher than that of L-ADM chemotherapy (46.72%±2.09%), ADM chemotherapy (35.09%±1.46%) and thermotherapy (17.85%±0.78%, P＜0.05), and the apoptotic rate of thermotherapy + L-ADM chemotherapy was higher than that of thermotherapy + ADM chemotherapy (P＜0.05).ConclusionThermotherapy can enhance proliferation inhibition and apoptosis induction effect of ADM and L-ADM on SWO-38 glioma cells, and this effect is even stronger with L-ADM.

doxorubicin; thermochemotherapy; cell proliferation; apoptosis

R739.410.53

A

0577-7402(2013)03-0201-03

2012-10-22；

2013-02-16)

(責任編輯：胡全兵)

史正華，碩士研究生。主要從事腦腫瘤方面的基礎(chǔ)與臨床研究

710032 西安 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科(史正華)；100048 北京 海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科(張劍寧)

張劍寧，E-mail：jnzhang2005@yahoo.com.cn