余爽，王靜，董冰，鮑依稀

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)作為常見的惡性腫瘤，占腫瘤病死率的第三位，其發(fā)病率在東南亞和非洲最高，在中國每年約有23萬人死于肝癌，占世界肝癌死亡人數(shù)的53%[1-3]。肝癌的發(fā)病機制仍不十分明確，其中涉及多個基因突變及表達異常[4-5]。

易洛魁族同源盒(iroquois homeobox，IRX)基因最早在果蠅的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究中被發(fā)現(xiàn)，編碼一個含高度保守同源盒序列的三氨基酸環(huán)延伸(three amino acid extension，TALE)超家族蛋白[6-7]。易洛魁家族有6個成員，IRX1－IRX6，它們又分兩簇，其中IRX1﹑IRX2與IRX4基因定位于5號染色體短臂5p15.33 位點或附近[8]，而IRX3﹑IRX5 和IRX6 基因定位于16 號染色體長臂16q11.2－q13區(qū)域[9]。有研究顯示，IRX1基因參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，可抑制胃癌細胞的增殖及侵襲[10]。Asaka等[11]報道IRX3基因在生存期較短的乳腺癌患者中的表達下降。IRX3在對雄激素不敏感的前列腺癌細胞株中的表達也下調(diào)[12]。Lewis等[13]研究顯示IRX2基因與乳腺癌上皮細胞生長和導(dǎo)管增殖有關(guān)。Rauch等[14]研究發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌中12個CpG島中有85%以上發(fā)生甲基化，與其相關(guān)基因包括EVX2﹑IRX2等。IRX2基因作為易洛魁基因家族成員，屬同源盒基因，具有轉(zhuǎn)錄因子活性[15]。最近對這一基因家族功能的研究日漸增多，而國內(nèi)外尚無 IRX2在肝癌中表達情況的報道。本研究通過檢測IRX2在肝癌組織與癌旁對照組織中的表達水平差異，探討IRX2在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2010年12月－2011年12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及第二醫(yī)院手術(shù)切除肝癌組織標本共51例。所有患者術(shù)前均未接受化療和放射治療。20例肝癌組織及癌旁組織標本于手術(shù)后立即取材(離體20min內(nèi))放入液氮，隨后轉(zhuǎn)入–80℃低溫冰箱保存以備RNA及蛋白抽提。另外31例肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織20例(11例缺乏相應(yīng)的癌旁組織)行常規(guī)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色以備病理組織學(xué)分期。病理分期采用Edmondson-Steiner模式，詳細臨床特征如表1所示。

表1 51例肝癌組織標本來源患者的臨床特征Tab. 1 Clinical characteristics of 51 patients with hepatocellular carcinoma

1.2 主要儀器試劑及檢測技術(shù) 定量PCR儀﹑Trans-blot 半干轉(zhuǎn)電泳槽﹑凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。RNAiso Plus試劑﹑反轉(zhuǎn)錄試劑(日本TaKaRa)，Eva@green熒光染料(美國Bio-Rad)，PIRA裂解液(北京百泰克生物)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒﹑化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)，DAB 顯色劑二抗(碧云天生物技術(shù)研究所)，β-actin(北京中山金橋)，IRX2抗體(Novus)。

1.2.1 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 取約80mg標本，液氮研磨后加入 1ml RNAiso plus試劑，常規(guī)步驟提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后，將取得的cDNA于–20℃保存。以cDNA為模板，引物序列如下。IRX2-F：TCGTCTACGGATCACTCG，IRX2-R：CCTCCAGGTCGTCATTGTC。內(nèi)參照β-actin-F:CCACTGGCATCGTGATGG，β-actin-R:GCGGATGTCCACGTCACACT。使用Bio-Rad公司Eva@green熒光染料試劑進行qRT-PCR相關(guān)操作，總反應(yīng)體系10μl。擴增條件：95℃ 3min；95℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 25s，共 39個循環(huán)；72℃7min，4℃暫停，目的基因與內(nèi)參照基因同時檢測，每個樣本設(shè)置3個重復(fù)孔，比較各組間的差異。

1.2.2 Western blotting檢測 收集組織標本，與行qRT-PCR檢測的組織樣本相同。經(jīng)RIPA裂解，4℃，13 000r/min離心15min。取上清。測蛋白質(zhì)濃度，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。一抗孵育(兔抗人IRX2多克隆抗體，Novus公司，1:500；鼠抗人β-actin多克隆抗體，北京中山金橋公司，1:1000)，4℃過夜，充分洗滌后加入HRP標記的二抗，室溫孵育1h，充分洗滌后ECL顯色。記錄結(jié)果。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測 采用鏈菌素親生物素-過氧化酶連接法(SP)行免疫組化檢測，按說明書操作，DAB顯色后觀察結(jié)果。高倍鏡下觀察結(jié)果，根據(jù)染色陽性腫瘤細胞胞核數(shù)目所占百分比計分，陰性為0分，陽性細胞占1%～33%計1分，34%～66%計2分，占67%以上計3分；染色強度按腫瘤細胞胞核著色的深淺計分：無著色為0分，黃色計1分，淺棕色計2分，棕褐色計3分。最后計算兩項之和：0分為(–)，2～3分為(+/–)，4～5分為()，6～7分為()其中()和()為陽性。

1.3 檢測標本及指標

1.3.1 肝癌及癌旁組織檢測 以20例肝癌組織與20例癌旁組織作為研究對象，采用qRT-PCR法檢測IRX2 mRNA的表達，采用Western blotting法檢測IRX2蛋白的表達。以所有31例肝癌組織及20例癌旁對照組織(其中11例缺乏相應(yīng)的癌旁組織)作為對象，采用免疫組化法觀察IRX2蛋白的表達情況。

1.3.2 肝癌組織檢測 取31例肝癌組織作為研究對象，采用免疫組化法檢測IRX2蛋白的表達情況；同時將此批肝癌組織按照病理分期分為高分化組(n=12)﹑中分化組(n=10)和低分化組(n=9)，分析3組癌組織IRX2蛋白的表達差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行分析。分析IRX2 mRNA和蛋白的半定量結(jié)果為計量資料，由于不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗進行分析；分析IRX2蛋白在肝癌組織和癌旁組織以及不同分化程度肝癌組織中相對表達量的差異時，計數(shù)資料表示為患者例數(shù)，采用Kruskal-Wallis H檢驗進行分析，多重比較采用K Independent Samples Test進行。P＜0.05示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌及癌旁組織檢測

2.1.1 IRX2 mRNA的表達 對20例肝癌組織與20例癌旁組織中IRX2基因表達量(以2–ΔΔCt表示)進行分析，結(jié)果顯示80%(16/20)的肝癌組織中IRX2基因表達量低于癌旁對照組，秩和檢驗顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.04)。

2.1.2 IRX2蛋白的表達

2.1.2.1 Western blotting檢測 該檢測結(jié)果與qRTPCR所得結(jié)果一致，肝癌組織(n=20)中IRX2蛋白表達的半定量結(jié)果低于癌旁對照組(n=20)，相對表達量的值分別為0.866和1.803。經(jīng)秩和檢驗證實差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009，圖1)。

2.1.2.2 免疫組化 IRX2蛋白陽性染色位于細胞核。在51例肝臟組織中，IRX2蛋白均呈陽性表達(表2)，在31例肝癌組織和20例癌旁組織中，IRX2蛋白陽性表達的組織分別為13例和20例，肝癌組織中IRX2蛋白的陽性率低于癌旁對照組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000，秩和檢驗)。

2.2 肝癌組織 對31例不同分化程度的肝癌組織分析發(fā)現(xiàn)，IRX2蛋白陽性染色表達在細胞核上，主要表現(xiàn)為粗糙深染的褐色顆粒。IRX2蛋白的表達量與腫瘤的分化程度相關(guān)，隨著肝癌組織分化程度的降低，陽性表達也隨之降低(圖2)。

在31例肝癌組織中，12例高分化肝癌組織﹑10例中分化肝癌組織以及9例低分化肝癌組織的IRX2蛋白表達情況見表3，秩和檢驗顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)；進一步兩兩對比發(fā)現(xiàn)，高分化與低分化肝癌組織﹑中分化與低分化肝癌組織IRX2蛋白的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而中分化與高分化肝癌組織IRX2蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 Western blotting檢測肝癌組織和癌旁組織IRX2蛋白的表達Fig. 1 Expression of IRX2 protein in hepatocellular carcinoma tissue and paired normal tissue (Western blotting)

表2 IRX2 蛋白的表達情況[例(%)]Tab. 2 Expression of IRX2 protein [case(%)]

圖2 IRX2蛋白的表達(SP ×400)Fig. 2 Expression of IRX2 protein (SP×400)

3 討 論

IRX2基因是易洛魁基因家族中的成員，定位于5號染色體短臂5p15.33位點或附近[9]。文獻報道該區(qū)域存在IRX1﹑IRX2和EEl等3個候選基因。IRX1和IRX2屬于易洛魁基因家族成員，作為同源盒基因，與胚胎的前腸發(fā)育相關(guān)，具有轉(zhuǎn)錄因子活性[15]。癌變的細胞中同源盒基因功能可能丟失或活化；而同源盒基因IRX2與肝腫瘤發(fā)生的關(guān)系尚未見報道。本研究中，由于有11例肝癌組織未取到相應(yīng)合格的癌旁組織標本，在檢測IRX2的表達差異中，僅20例的肝癌組織與其癌旁組織相對應(yīng)。qRT-PCR結(jié)果證實，HCC組中IRX2 mRNA的表達低于癌旁對照組織中的表達。為進一步了解IRX2蛋白在HCC組和癌旁對照組的表達差異以及IRX2蛋白表達與HCC分化程度的關(guān)系，本研究采用Western blotting及免疫組化技術(shù)進行分析，結(jié)果顯示IRX2蛋白主要位于細胞核，IRX2蛋白在HCC組中的表達低于癌旁對照組織。在分化程度越低，惡性程度越高的肝癌組織中，IRX2蛋白的表達量越低。

表3 IRX2蛋白在不同分化程度肝癌組織中的差異表達[例(%)]Tab. 3 Differentiated expression of IRX2 in hepatocellular carcinoma tissue at different histopathologic stages [case(%)]

有研究發(fā)現(xiàn)，許多抑癌基因啟動子區(qū)的CpG島甲基化后造成相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄障礙，導(dǎo)致細胞惡化[16-17]。DNA甲基化異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，可導(dǎo)致一種或多種抑癌基因沉默。隨著對易洛魁基因家族研究的深入，Rauch等[14]研究發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌中，12個CpG島中有85%～100%發(fā)生甲基化，其中牽涉BARHL2﹑IRX2等基因。Kamalakaran等[18]在研究乳腺癌時發(fā)現(xiàn)CpG島在管狀A(yù)型乳癌的HOXA族和同源盒基因(IRX2﹑DLX2﹑NKX2-2)甲基化的發(fā)生明顯增加。

啟動子調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)量并決定轉(zhuǎn)錄的組織特異性。有研究顯示，根據(jù)啟動子結(jié)構(gòu)特征將基因分為甲基化易感基因與甲基化抵抗基因，其中不斷進行轉(zhuǎn)錄的基因能間接防止CpG島的甲基化(如管家基因﹑MYC﹑FOS和CDK6等)，而呈限制性表達的基因容易發(fā)生甲基化(多為組織特異性基因，如同源盒類基因CDX2和IPF1等)。目前，去甲基化治療已成為腫瘤研究中的又一新領(lǐng)域。本課題組研究結(jié)果顯示IRX2在原發(fā)性肝癌組織中異常表達，提示IRX2可能與肝臟腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但是否與甲基化相關(guān)以及其具體機制并不完全清楚，本課題組將進行進一步的研究。

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