李海勝，杜鵑，王海燕，岳彩黎，楊策，蔣建新

在肺臟基礎(chǔ)和臨床研究中，鑒于肺臟獨特的解剖結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的細胞組成[1]，科學(xué)取材﹑規(guī)范處理組織標(biāo)本是各種肺臟病理研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和先決條件。肺臟體積的90%為空氣，僅10%為組織，再加上肺臟獨特的囊泡結(jié)構(gòu)，所以肺臟固定成為具有一定難度的問題。目前，關(guān)于肺臟固定存在方法不統(tǒng)一﹑條件不一致等問題，導(dǎo)致不同研究結(jié)果間可比性差，并出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)問題，如肺泡塌陷﹑變形﹑肺泡結(jié)構(gòu)破壞，甚至出現(xiàn)肺間隔增厚﹑細胞數(shù)目增多﹑出血﹑肺泡體積增大等人工假象[2]。肺臟固定存在的問題最終使后續(xù)的體視學(xué)形態(tài)定量分析失去診斷意義。因此，優(yōu)化并規(guī)范肺臟固定方法以提高病理診斷價值顯得尤為重要。本研究以大鼠為研究對象，分別采用單純氣管內(nèi)固定﹑單純肺循環(huán)固定和氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定等三種肺臟固定方法，利用HE染色﹑免疫熒光染色定性觀察和體視學(xué)定量分析不同方法對肺泡結(jié)構(gòu)和細胞抗原的影響，旨在確認能客觀反映肺臟病理變化的最佳操作流程，為基于形態(tài)定量分析的肺臟病理診斷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠，雌雄不限，體重約250g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心[許可證號SCXK(軍)2007-017]提供。飼養(yǎng)室恒溫22±2℃，明暗各12h交替循環(huán)條件下飼養(yǎng)，自由飲食﹑飲水。

1.2 主要器材和試劑 手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械，中國)。頭皮針(上海金塔醫(yī)療器械，中國)，16G靜脈留置針(B.Braun，德國)，熒光顯微鏡(Olympus，日本)，石蠟包埋機和石蠟切片機(Leica，美國)；40%福爾馬林溶液(廣東光華，中國)；正常驢血清(Jackson，017-000-121，美國)，pro-SPC(Santa cruz，SC7706，美國)，Ki67(Abcam，ab66055，英國)，AF488(Invitrogen，A21206，美國)，AF594(Invitrogen，A11058，美國)，DAPI(Sigma，D8417，美國)。

1.3 中性緩沖福爾馬林(neural buffer formalin，NBF)配制方法[3]40%福爾馬林原液10ml，NaH2PO4·H2O 400mg，Na2HPO4650mg，ddH2O 90ml，充分混勻，調(diào)整pH=7.2～7.4。

1.4 實驗分組 將15只大鼠隨機分為3組：單純氣管內(nèi)固定組﹑單純肺循環(huán)固定組﹑氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定組，每組5只。

1.5 單純氣管內(nèi)固定法 大鼠腹腔注射60mg/kg的2%戊巴比妥鈉麻醉，尾靜脈注射300U/kg濃度為500U/ml的濃肝素行全身肝素化。游離暴露氣管，行氣管插管。開腹暴露并剪斷腹主動靜脈放血，向上剪破膈肌使肺臟萎陷，開胸暴露心臟和肺臟，以25cmH2O壓力經(jīng)氣管插管灌注NBF，持續(xù)10min；結(jié)扎氣管，整肺浸入NBF，4℃過夜。

1.6 單純肺循環(huán)固定法 大鼠麻醉﹑肝素化同前；開腹暴露并剪斷腹主動靜脈放血，開胸暴露心臟和肺臟，于右心室中下1/3穿刺進針行肺動脈置管，注射器經(jīng)肺動脈置管5min內(nèi)先后推入50ml PBS和50ml NBF，后續(xù)處理同前。

1.7 氣管和肺循環(huán)聯(lián)合固定法 大鼠麻醉﹑肝素化同前；游離暴露氣管，行氣管插管；開腹暴露并剪斷腹主動靜脈放血，向上剪破膈肌使肺臟萎陷，開胸暴露心臟和肺臟，于右心室中下1/3穿刺進針行肺動脈置管，以25cmH2O壓力經(jīng)肺動脈置管滴入5IU/ml肝素化PBS，直至肺完全變白；以25cmH2O壓力經(jīng)氣管插管灌注NBF，持續(xù)10min；待肺充盈后以25cmH2O壓力經(jīng)肺動脈置管滴入NBF，持續(xù)10min，后續(xù)處理同前。

1.8 組織塊抽樣和切片 游離右下肺，按照2mm間隔橫切成4～5個組織片，每個組織片從中間矢狀切成2個組織塊，每只大鼠共8～10個組織塊，依次編號，按照等距隨機抽樣的原則選擇2～3個組織塊，抽取的組織塊放入NBF，負壓抽吸使其沉入瓶底，繼續(xù)4℃固定48h。固定完成后梯度酒精脫水，氯仿透明，浸蠟，以靠近肺尖的橫切面為底面進行石蠟包埋。按照5μm厚度切片，每個組織塊連續(xù)切2張，第1張行HE染色，第2張行免疫熒光染色。

1.9 免疫熒光染色 石蠟切片脫蠟至水，0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)高壓修復(fù)2.5min，0.2%TritonX-100穿孔15min，10%正常驢血清室溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1h，DAPI室溫孵育5min，抗熒光淬滅封片劑封固，熒光顯微鏡采集圖像。一抗包括：Ⅱ型肺泡上皮標(biāo)志pro-SPC(鵝抗小鼠，1:30)，表達于細胞質(zhì)；增殖標(biāo)志物Ki67(兔抗小鼠，1:200)，表達于細胞核；二抗包括：AF594(驢抗鵝，1:400)，AF488(驢抗兔，1:400)。

1.10 觀察指標(biāo) 肺泡結(jié)構(gòu)和細胞抗原：HE染色觀察肺泡大小﹑肺泡形態(tài)﹑肺間隔等肺泡結(jié)構(gòu)變化，免疫熒光染色觀察胞質(zhì)抗原pro-SPC和胞核抗原Ki67的陽性信號數(shù)量﹑分布和強度。

肺泡線性截距(Lm)：由圖1A可見，每張切片隨機選取4個非重疊400倍視野，Photoshop疊加6×7水平測試線段，以左側(cè)端點為計數(shù)點，計數(shù)位于肺泡腔的左側(cè)端點數(shù)(P)和測試線段與肺間隔的交點數(shù)(I)，Image J軟件測量測試線段長度(d)，根據(jù)公式Lm=2×[(d×p)/I]計算Lm值[4]。肺實質(zhì)體積密度(Vv)：組織切片和視野選取方法同圖1A；由圖1B可見，Photoshop疊加9×9測試點，計數(shù)時以“十”字測試點的右上象限為準(zhǔn)，右上象限擊中肺實質(zhì)即進行計數(shù)，得到落在肺實質(zhì)上的總點數(shù)(Pp)和視野內(nèi)所有測試點數(shù)目(PL)，根據(jù)公式Vv=Pp/PL計算Vv值[5]。肺間隔厚度(T)：組織切片和視野選取方法同圖1A，由圖1C可見，Photoshop疊加5條水平測試線，Image J軟件測量被測試線貫穿且夾角大于60°的肺間隔厚度[6](圖1)。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS 13.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析，Scheffe法進行兩兩比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 肺形態(tài)定量分析指標(biāo)Lm(A)﹑Vv(B)﹑T(C)測定示意圖Fig. 1 Diagrammatic sketch of determination of lung morphological measurements, Lm(A), Vv(B) and T(C)

2 結(jié) 果

2.1 不同固定方法對肺泡結(jié)構(gòu)的影響 大體觀察發(fā)現(xiàn)，單純氣管內(nèi)固定組肺臟呈紅色，單純肺循環(huán)固定組和氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定組肺臟呈白色，各組肺臟大小無明顯差異。HE染色發(fā)現(xiàn)單純氣管內(nèi)固定組血管內(nèi)和肺間隔可見大量紅細胞聚集，肺間隔略有增厚，但肺間隔無斷裂，肺泡腔無明顯擴大(圖2A)；單純肺循環(huán)固定組血管內(nèi)和肺間隔未見紅細胞，但肺間隔明顯增厚，肺泡變形，并且肺間隔內(nèi)出現(xiàn)空泡，可能為固定不完全的組織溶解形成的空洞或殘留的氣體(圖2B)；氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定組血管和肺間隔無紅細胞殘留，肺間隔菲薄，肺泡形態(tài)自然，固定效果最好(圖2C)。

2.2 不同固定方法對細胞抗原的影響 對細胞質(zhì)抗原pro-SPC的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，單純氣管內(nèi)固定組未出現(xiàn)陽性染色，而單純肺循環(huán)固定組的陽性細胞數(shù)明顯多于氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定組(圖3AC)。對細胞核抗原Ki67染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純氣管內(nèi)固定組的陽性細胞數(shù)少于氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定組和單純肺循環(huán)固定組(圖3D－F)。

2.3 不同固定方法對Lm的影響 單純肺循環(huán)固定組肺泡Lm最小，單純氣管固定組肺泡腔Lm略有增高，但與單純肺循環(huán)固定組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定組肺泡腔Lm較其他兩組均有增高，但僅與單純肺循環(huán)固定組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

圖2 不同固定方法對肺泡結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of different fixation methods on alveolar structure

圖3 不同固定方法對細胞抗原的影響Fig. 3 Effect of different fixation methods on cell antigen

2.4 不同固定方法對Vv的影響 在三種固定方法得到的肺組織中，單純肺循環(huán)固定組肺Vv最大，單純氣管內(nèi)固定組次之，氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定組最小，且各組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

2.5 不同固定方法對T的影響 三種固定方法中，單純肺循環(huán)固定組的T最大，單純氣管內(nèi)固定組次之，氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定組最小，且各組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

表1 不同固定方法對肺形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響Tab. 1 Effect of different fixation methods on lung morphometric index

3 討 論

科學(xué)規(guī)范地肺臟取材是肺臟基礎(chǔ)和臨床研究的重要先決條件。目前常用的肺臟固定方法主要有直接浸泡固定[7]﹑壓力或體積控制肺循環(huán)灌洗固定[8]﹑壓力或體積控制氣管灌注固定[9-11]﹑氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定[12]，但比較各種方法固定效果的文獻極少，且大部分均為定性觀察，鮮有文獻對各種方法的優(yōu)劣進行客觀化定量評價。本研究利用普通的定性觀察和客觀的體視學(xué)定量分析，評價了三種常見固定方法對肺泡結(jié)構(gòu)和細胞抗原的影響，為基礎(chǔ)研究和臨床診斷中肺臟固定方法的選擇提供了可靠的實驗依據(jù)。

肺組織固定中，最為關(guān)鍵的參數(shù)是固定液的種類﹑氣管內(nèi)灌注壓力﹑肺循環(huán)灌洗壓力等。常用的固定液主要包括福爾馬林和多聚甲醛。一般認為，福爾馬林是甲醛的水溶液，甲醛在水溶液中易聚合生成不溶的白色沉淀即多聚甲醛，商品化的福爾馬林僅含37%～40%甲醛，還包含10%甲醇和其他甲酸鹽等雜質(zhì)。但是福爾馬林和多聚甲醛均以單體形式與蛋白質(zhì)交聯(lián)發(fā)揮固定作用。實際上，福爾馬林溶于pH為7.2～7.4的緩沖液時，其中的低聚物可以迅速解聚為單體形式；多聚甲醛中的高聚物則需加熱等其他處理才能解聚為單體形式的甲醛。因此，10%中性福爾馬林緩沖液(NBF)可以快速穿透組織，收縮性小，在有效保護抗原的同時能很好保持形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性，應(yīng)用最為廣泛，更適合推廣[13]。美國胸科協(xié)會和歐洲呼吸協(xié)會(ATS/ERS)推薦的氣道灌注壓力為20～25cmH2O，可將肺固定于肺總量的生理擴張狀態(tài)[14-15]。生理狀態(tài)下肺動脈壓力為15～20mmHg(20.4～27.2cmH2O)，因此25cmH2O的肺循環(huán)灌注壓力既可保證肺循環(huán)灌注徹底，又可避免灌注壓過大引起的液體外滲。實際操作時需要注意以下幾點：①用于氣管和肺循環(huán)灌注的整個管道系統(tǒng)應(yīng)盡可能粗﹑短，而且使得液體具備一定流速；②灌注管道內(nèi)不能殘留氣體，因為氣體會引起肺動脈堵塞，影響灌注效果；③氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定時，氣管內(nèi)固定一定要早于肺循環(huán)固定，因為肺循環(huán)固定后肺組織即失去彈性不能回縮，肺內(nèi)存在大量氣體。氣管灌注時，固定液不易進入肺泡腔，甚至?xí)浩葰怏w從肺表面溢出造成肺泡破裂，而如果首先進行氣管灌注，在開始灌注前，肺組織的彈性回縮力會排出肺內(nèi)大部分的氣體，從而利于固定液快速入肺；④整肺置于NBF固定過夜可以在排除肺重力影響的狀態(tài)下使肺組織變硬，所以在后續(xù)切割組織塊時可避免壓迫組織。

任何一種固定方法的目的都是盡可能將操作本身對組織狀態(tài)的影響降至最低，最終體現(xiàn)組織的真實情況。理想狀態(tài)下，固定后各種組織結(jié)構(gòu)和抗原應(yīng)該沒有任何改變，不會出現(xiàn)任何類型的“人工假象”。定性觀察發(fā)現(xiàn)，在肺泡結(jié)構(gòu)完整性方面，單純氣管內(nèi)固定組肺間隔較薄，肺泡形態(tài)比較自然，但由于未去除紅細胞，所以肺間隔和血管內(nèi)存在大量紅細胞，部分組織甚至出現(xiàn)肺泡內(nèi)出血假象；單純肺循環(huán)固定雖然可避免血管內(nèi)紅細胞對組織結(jié)構(gòu)的影響，但出現(xiàn)肺間隔增厚﹑肺泡變形﹑部分肺間隔空泡假象等情況；總體而言，氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定既可消除紅細胞的影響又能更好保存肺泡結(jié)構(gòu)，固定效果最好。在抗原保存方面，由于Ⅱ型肺泡上皮細胞可以增殖﹑分化并替代損傷脫落的Ⅰ型肺泡上皮細胞[16]，最終修復(fù)肺泡上皮。目前由損傷介導(dǎo)的Ⅱ型肺泡上皮細胞增殖能力的變化是主要研究熱點，因此我們通過Ⅱ型肺泡上皮細胞特異標(biāo)志物pro-SPC和細胞增殖標(biāo)志物Ki67的免疫熒光雙染來評價不同固定方法對細胞抗原的保存效果。結(jié)果表明氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定和單純肺循環(huán)固定對抗原的保存效果都比較好，單純氣管內(nèi)固定則相對較差，但是單純肺循環(huán)固定會引起肺泡腔縮小，導(dǎo)致視野內(nèi)陽性細胞數(shù)目明顯多于氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定。綜合考慮，氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定對肺泡結(jié)構(gòu)和細胞抗原的保存效果最好。

肺泡線性截距Lm主要反映肺泡腔的擴張程度，常用來評價肺氣腫嚴重程度，Lm越大肺泡腔越大，Lm越小肺泡腔越小[4,14]，正常情況下Lm為35～40μm[1-2]。形態(tài)定量分析發(fā)現(xiàn)，氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定組和單純氣管內(nèi)固定組的Lm值均在正常范圍內(nèi)且并無明顯差異，但顯著高于單純肺循環(huán)固定組，提示氣管內(nèi)滴注固定液可以減少肺泡的萎縮和塌陷。肺實質(zhì)體積密度(Vv)指單位體積肺組織中含有的肺實質(zhì)體積，常用來評價肺實變程度，Vv越大肺實變越嚴重；而肺間隔厚度可以從結(jié)構(gòu)上反映氣體交換能力，生理情況下肺間隔越薄氣體交換能力越強[14]；由于我們研究的區(qū)域主要為肺泡區(qū)域，肺實質(zhì)幾乎全為肺間隔，因此肺間隔厚度和Vv有一定的相關(guān)性，肺間隔越厚，Vv越大。體視學(xué)分析結(jié)果顯示，單純肺循環(huán)固定組的肺間隔增厚和Vv最大，單純氣管內(nèi)固定組次之，氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定組最小，提示單純肺循環(huán)固定會造成肺間隔增厚的假象，進而造成Vv的增高；雖然單純氣管內(nèi)固定組肺間隔厚度較單純肺循環(huán)固定組明顯降低，但由于肺間隔有紅細胞殘留，肺間隔增厚和Vv也略大；氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定組從肺泡腔和血管腔雙重固定，利于固定液的快速滲透，從而減少組織離體后和接觸固定液前的自溶時間，最終固定的肺間隔菲薄，Vv也相應(yīng)較小。因此，氣管肺循環(huán)聯(lián)合固定法更能真實反映處于功能狀態(tài)下的肺組織結(jié)構(gòu)。

當(dāng)然，沒有任何一種“萬能”的固定方法，我們需要根據(jù)研究目的進行選擇。單純肺循環(huán)固定雖然可以避免紅細胞對組織結(jié)構(gòu)的影響，但不能觀察肺充血﹑出血的病理表現(xiàn)；單純氣管內(nèi)固定雖然可以更好地固定肺間隔，保持肺泡形態(tài)，但由于灌洗液進入肺泡時的沖洗作用，會對反映肺泡腔內(nèi)病理改變的指標(biāo)(如水腫液﹑肺泡表面活性物質(zhì)﹑肺泡腔內(nèi)炎性細胞等)有影響[17]?？傊瑲夤芊窝h(huán)聯(lián)合固定法可以更好地保存肺泡結(jié)構(gòu)和抗原，適用于各種以肺泡結(jié)構(gòu)和細胞抗原為研究對象的病理基礎(chǔ)和臨床研究。

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