鄭楠，張寧坤，高連如，徐小紅，王力，朱智明

外源性apelin-13對(duì)心肌梗死大鼠心肌干細(xì)胞的動(dòng)員作用觀察

鄭楠，張寧坤，高連如，徐小紅，王力，朱智明

目的探討給予外源性apelin-13對(duì)急性心肌梗死(AMI)后大鼠心臟的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法SD大鼠隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組(n=6)、對(duì)照組(AMI+生理鹽水，n=12)和實(shí)驗(yàn)組(AMI+apelin-13，n=12)，其中對(duì)照組死亡4只，實(shí)驗(yàn)組死亡5只，其余對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠于冠脈結(jié)扎術(shù)后5min內(nèi)分別向心肌內(nèi)注射生理鹽水20μl或apelin-13 0.2μg/20μl，假手術(shù)組大鼠僅開(kāi)胸，未進(jìn)行冠脈結(jié)扎也未進(jìn)行藥物注射。采用超聲心動(dòng)圖和心肌梗死面積測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)心臟功能的變化。采用免疫組化染色法檢測(cè)心肌組織C-kit、Flk1、Sca1蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況，Western blotting和Real Time-PCR法定量檢測(cè)前述蛋白和mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果超聲心動(dòng)圖及心肌梗死面積測(cè)定結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠心功能較對(duì)照組有所改善(左室射血分?jǐn)?shù)：實(shí)驗(yàn)組為68.43%±2.06%，對(duì)照組為46.40%±15.18%；左室短軸縮短率：實(shí)驗(yàn)組為33.70%±1.55%，對(duì)照組為20.73%±8.14%；梗死心肌面積百分比：實(shí)驗(yàn)組為16.10%±3.08%，對(duì)照組為33.83%±5.64%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免疫組化染色顯示，假手術(shù)組心肌組織C-kit、Flk1、Sca1表達(dá)呈陰性，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組染色呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性。Western blotting和RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組C-kit、Flk1、Sca1蛋白及mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(蛋白水平：C-kit 0.48±0.17vs1.05±0.08，F(xiàn)lk1 0.40±0.26vs0.88±0.10，Sca1 0.39±0.08vs0.70±0.08，P＜0.05；mRNA水平：C-kit 2.89±1.89vs18.77±14.19，F(xiàn)lk1 2.14±0.95vs4.59±0.92，Sca1 4.32±2.44vs29.39±11.90，P＜0.05)，而假手術(shù)組C-kit、Flk1、Sca1蛋白無(wú)明顯表達(dá)。結(jié)論外源性apelin-13蛋白對(duì)心肌梗死大鼠具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與刺激內(nèi)源心肌干細(xì)胞的分裂增殖有關(guān)。

apelin；心肌干細(xì)胞；心肌梗死

盡管心衰的治療近年來(lái)取得了較大進(jìn)展，但仍是心血管病第一位的死亡原因。近來(lái)新發(fā)現(xiàn)的心血管活性肽apelin-13具有降低血壓、增強(qiáng)心肌收縮力、促進(jìn)新生血管生成、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)水鹽及脂肪代謝等作用[1]，且實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)急性缺血再灌注損傷及心梗后心衰的動(dòng)物模型也具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制仍不十分清楚[2-4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的過(guò)程中，apelin/APJ信號(hào)通路可發(fā)揮重要調(diào)控作用[5-6]，但apelin在體內(nèi)是否也可介導(dǎo)心肌干細(xì)胞(cardiac stem cells，CSCs)動(dòng)員，參與心肌保護(hù)及限制心室重構(gòu)，從而改善心功能，目前國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道較少。

隨著細(xì)胞移植技術(shù)和相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)在人和動(dòng)物的心臟組織中有少量的CSCs。目前認(rèn)為CSCs是指細(xì)胞膜上能夠表達(dá)一種或多種干細(xì)胞相關(guān)抗原，如干細(xì)胞因子受體(C-kit)、干細(xì)胞抗原1(Sca-1)等多能干細(xì)胞表面標(biāo)志，而且CSCs能在一定條件下分化為各種心肌細(xì)胞的未分化細(xì)胞[7]。Flk1是內(nèi)皮細(xì)胞和側(cè)板中胚層的早期標(biāo)志，F(xiàn)lk1+胚胎干細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞，三維培養(yǎng)可形成血管[8]，F(xiàn)lk1+誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有與Flk1+胚胎干細(xì)胞相同的心肌、血管分化潛能[9]。由此可見(jiàn)，F(xiàn)lk1+干細(xì)胞為心血管前體細(xì)胞，F(xiàn)lk1可作為干細(xì)胞中心血管前體細(xì)胞的表面標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支建立急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)模型，觀察外源性輸入apelin-13是否對(duì)AMI大鼠具有保護(hù)作用，并進(jìn)一步檢測(cè)apelin對(duì)CSCs(以C-kit+、Sca1+、Flk1+為標(biāo)準(zhǔn))的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與分組 健康雄性SD大鼠30只，體重250±20g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按照摸球法隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組6只，對(duì)照組12只，實(shí)驗(yàn)組12只。其中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的24只大鼠采取冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制作急性心肌梗死模型，術(shù)中及術(shù)后對(duì)照組死亡4只，實(shí)驗(yàn)組死亡5只，最后對(duì)照組為8只，實(shí)驗(yàn)組為7只。具體建模方法：以鹽酸氯胺酮20mg/kg、速眠新Ⅱ 0.2mg/kg進(jìn)行肌肉注射麻醉。呼吸機(jī)設(shè)置為容量控制模式，潮氣量10～15ml/250g體重，呼吸頻率為50～60次/min，吸呼比為1:1，通氣量為潮氣量+1ml。開(kāi)胸后，分離胸膜，在左心耳下緣、肺動(dòng)脈圓錐水平結(jié)扎左前降支。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為：心電圖標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)Ⅱ?qū)?lián)ST段呈弓背型抬高；結(jié)扎動(dòng)脈遠(yuǎn)端心肌出現(xiàn)蒼白。假手術(shù)組大鼠僅開(kāi)胸未行冠脈結(jié)扎，也未行藥物注射。實(shí)驗(yàn)組大鼠在AMI手術(shù)完成后5min之內(nèi)從缺血梗死心肌周?chē)?、3、6、9點(diǎn)鐘4個(gè)方向共注入0.2μg(20μl) apelin-13；對(duì)照組以同樣方法注入生理鹽水20μl。各組術(shù)后連續(xù)3d肌內(nèi)注射青霉素40萬(wàn)U，注意保溫(至少12h)，統(tǒng)一給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及飲水。

1.2 主要試劑 Apelin-13(Santa Cruz公司)；一抗兔抗大鼠Sca1、Flk1(北京百事創(chuàng)新科技有限公司)，一抗兔抗大鼠C-kit、內(nèi)參β-actin(北京博奧森生物技術(shù)公司)；蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒(北京奧博來(lái)生物技術(shù)公司)，ECL發(fā)光試劑盒(北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(河北博海生物工程有限公司)；Trizol(南京凱基生物科技有限公司)，RTPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus) (大連寶生物公司)；TTC染液(南京建成科技有限公司)。

1.3 心臟標(biāo)本的處理 建模后2周，每組隨機(jī)取3只大鼠行經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查，而后采取頸椎脫臼法處死，開(kāi)胸剪取心臟，剔除血管脂肪等非心肌組織，用冷生理鹽水沖洗，放入－20℃冰箱速凍，用于心肌梗死面積檢測(cè)。再以同樣方法處理剩余大鼠的心臟標(biāo)本(其中假手術(shù)組3只、對(duì)照組5只、實(shí)驗(yàn)組4只)，然后每只心臟標(biāo)本沿梗死心肌邊緣用消毒剪將梗死心肌剪成若干黃豆大小的組織塊，用錫紙將剪好的組織塊包被后迅速置于液氮中凍存，以備后續(xù)用于Western blotting和Real Time-PCR檢測(cè)；再將剩余的心臟標(biāo)本用4%甲醛固定，以備后續(xù)用于免疫組化檢測(cè)。

1.4 大鼠心臟功能的檢測(cè) 采用SEUIA512彩色多普勒超聲儀(SIEMENS)檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)為：左室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)、左室舒張末徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd)、左室收縮末徑(left ventricular end-systolic diameter，LVEDs)及左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)。各組原始數(shù)據(jù)均取自3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值。

1.5 TTC染色檢測(cè)心肌梗死面積 將心臟標(biāo)本放入－20℃冰箱速凍20min后，沿與心臟長(zhǎng)軸垂直方向自心尖向心底連線中點(diǎn)處行2～3mm的心室組織切片，將切片置于TTC染液中，放入37℃溫箱避光染色20min，非梗死區(qū)染色呈紅色，梗死區(qū)呈灰白色。Olympus數(shù)碼相機(jī)拍照，然后采用PhotoShop圖像分析系統(tǒng)測(cè)量心室及梗死區(qū)面積，計(jì)算梗死面積百分比。梗死面積(%)＝心室組織切片梗死區(qū)面積/心室組織切片總面積×100%。

1.6 免疫組化檢測(cè)心肌組織C-kit、Flk1、Scal蛋白的表達(dá) 將用4%甲醛固定的心臟標(biāo)本取出，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉液室溫封閉20min；加一抗(抗體稀釋比例為1:80)，4℃孵育過(guò)夜；加二抗，37℃孵育20min；加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)37℃孵育20min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，光鏡下觀測(cè)并拍照。染色結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行分級(jí)。陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分；細(xì)胞染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。陽(yáng)性強(qiáng)度為兩種計(jì)分的乘積：0～2分為陰性(–)、3～5分為弱陽(yáng)性(+)、6～8分為陽(yáng)性()、9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性()。結(jié)果判定由兩位病理科醫(yī)師分別進(jìn)行，取平均值。

1.7 Western blotting檢測(cè)各組心肌組織C-kit、Flk1、Sca1蛋白表達(dá) 取凍存組織，液氮研磨，迅速加入120μl TSB，冰上繼續(xù)研磨均勻，將研磨產(chǎn)物轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，4℃、12 000r/min離心5min，取上清于新的滅菌管。用Bradford法(北京奧博來(lái)公司蛋白定量試劑盒)定量蛋白，每個(gè)樣品取900μg，調(diào)整體積至60μl，加入1/5體積6×上樣緩沖液，混勻，置于沸水浴10min，取出，4℃、12 000r/min離心5min，然后將每個(gè)樣品(60μl)進(jìn)行上樣(檢測(cè)β-actin、Flk1時(shí)每個(gè)樣品取10μl；檢測(cè)C-kit、Sca1時(shí)每個(gè)樣品取20μl)，上樣后電泳，各泳道分別加彩色預(yù)染Marker及樣品蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，NC膜濕轉(zhuǎn)，加一抗(抗體稀釋比例C-kit、Flk1、Sca1為1:200，β-actin為1:1000)，4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2h，超敏ECL化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。BandScan軟件分析結(jié)果條帶。以C-kit、Flk1、Sca1蛋白與β-actin蛋白條帶灰度比值進(jìn)行半定量分析。

1.8 Real Time-PCR檢測(cè)心肌組織C-kit、Flk1、Sca1 mRNA的表達(dá) 按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA，采用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用Bio-Rad進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，總反應(yīng)體系25μl。擴(kuò)增條件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 60s，共40個(gè)循環(huán)。引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成。相關(guān)引物序列如下：C-kit上游引物5'-AGCAAGAGTTAACGATTCCGGAG-3'，下游引物5'-CCAGAAAGGTGTAAGTGCCTCCT-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度344bp；Flk1上游引物5'-CCTGGCGATTTTCTCCAT C-3'，下游引物5'-CATTCAGTCACCAATACCCTTT CC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度162bp；Sca1上游引物5'-CTAGAGA ACCCACGGGGAGA-3'，下游引物5'-TCTCACGTTT CTTGGGAGGC-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度195bp；GAPDH上游引物5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3'，下游引物5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度92bp。擴(kuò)增結(jié)束后讀取Ct值，結(jié)果以2-ΔΔCt法表示，分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組C-kit、Flk1、Sca1 mRNA的表達(dá)差異。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果均以表示。多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 彩色多普勒超聲測(cè)量結(jié)果 對(duì)照組大鼠的LVEDs顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，而EF和FS顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05)，表明心肌梗死后大鼠心腔明顯擴(kuò)大，且心功能明顯下降；實(shí)驗(yàn)組大鼠的LVEDs較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，EF和FS明顯增加(P＜0.05)，但與假手術(shù)組比較無(wú)明顯差異(表1)。

2.2 大鼠心肌梗死面積的測(cè)定 利用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定心室梗死區(qū)面積與心室總面積比發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠心肌梗死面積與假手術(shù)組比較明顯增加(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌梗死面積與對(duì)照組相比明顯減少(P＜0.05，表1、圖1)。

表1 各組大鼠心功能及梗死面積比較(±s，n=3)Tab.1 Comparison of rat cardiac function and infarct size in each group (±s,n=3)

表1 各組大鼠心功能及梗死面積比較(±s，n=3)Tab.1 Comparison of rat cardiac function and infarct size in each group (±s,n=3)

LVEDd. Left ventricular end-diastolic diameter; LVEDs. Left ventricular end-systolic diameter; EF. Left ventricular ejection fraction; FS. Left ventricular fractional shortening. (1)P＜0.05 compared with sham-operated group; (2)P＜0.05 compared with control group

GroupLVEDd(mm)LVEDs(mm)EF(%)FS(%)Infarction area(%) Sham-operated group8.03±0.735.07±0.4972.60±1.8537.13±1.483.23±1.27 Control group9.00±1.317.20±1.71(1)46.40±15.18(1)20.73±8.14(1)33.83±5.64(1)Experimental group7.07±0.064.67±0.06(2)68.43±2.06(2)33.70±1.55(2)16.10±3.08(1)(2)

圖1 各組大鼠心肌梗死面積檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Rat myocardial infarct size of each group

2.3 免疫組化染色結(jié)果 C-kit陽(yáng)性著色位于胞膜和(或)胞質(zhì)，F(xiàn)lk1、Sca1陽(yáng)性著色位于胞膜和胞質(zhì)中，呈淡黃色至棕黃色顆粒狀。假手術(shù)組C-kit、Flk1、Sca1免疫組化染色呈陰性，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中C-kit、Flk1、Sca1染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多，呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌組織C-kit、Flk1、Sca1免疫組化染色結(jié)果(×400)Fig.2 C-kit, Flk1 and Sca1 expression in rat myocardial tissue detected by immunohistochemistry (×400)

2.4 Western blotting檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組C-kit、Flk1、Sca1蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)，且實(shí)驗(yàn)組C-kit、Flk1、Sca1蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，假手術(shù)組C-kit、Flk1、Sca1蛋白基本不表達(dá)(圖3)。

圖3 C-kit、Flk1、Sca1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Expression of C-kit, Flk1 and Sca1 protein detected by Western blotting

2.5 Real Time-PCR檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組C-kit、Flk1、Sca1 mRNA表達(dá)水平分別為18.77±14.19、4.59±0.92、29.39±11.90，與對(duì)照組(分別為2.89±1.89、2.14±0.95、4.32±2.44)相比均明顯增加(t值分別為－2.519、－3.899、－4.143，P＜0.05或P＜0.01)。

3 討 論

Apelin是1998年日本學(xué)者Tatemoto等[10]利用孤兒受體策略，以反向藥理學(xué)方法從牛胃組織提取物中分離出的一種小分子多肽，為G蛋白偶聯(lián)受體APJ(angiotensin Ⅱ protein J，APJ)的內(nèi)源性配體?，F(xiàn)已純化的有apelin-10、11、12、13、15、17、19、28、36等多種肽，不同的肽片段具有不同的生物學(xué)效應(yīng)，其中apelin-13生物活性可能最強(qiáng)。Apelin/ APJ信號(hào)與血管緊張素Ⅱ/血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ type 1，AT1)信號(hào)系統(tǒng)分布相似，具有調(diào)節(jié)免疫、降低血壓、增強(qiáng)心肌收縮力、保護(hù)心肌損傷、促進(jìn)新生血管生成、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)水鹽及脂肪代謝等作用。研究證實(shí)apelin對(duì)于急性缺血再灌注損傷及心肌梗死后心衰的動(dòng)物模型都具有保護(hù)作用[2-4,11]，其機(jī)制與抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管生成有關(guān)[2]，但對(duì)于apelin促進(jìn)心臟結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)的詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

近年研究發(fā)現(xiàn)，apelin/APJ信號(hào)通路在心血管定向分化中具有極其重要的作用。干預(yù)apelin/APJ表達(dá)會(huì)影響青蛙胚胎的心臟發(fā)育；在斑馬魚(yú)胚胎中，如局部apelin缺乏，則心臟前體細(xì)胞不能到達(dá)特定的生心區(qū)(胚胎前側(cè)中胚葉區(qū)域)；另外，Cripto-/-鼠胚胎干細(xì)胞(ESCs)中幾乎測(cè)不出apelin/ APJ表達(dá)，而且不會(huì)分化成心肌細(xì)胞，但通過(guò)基因轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)APJ可促使Cripto-/-ESCs向心肌細(xì)胞分化[12-13]。Gao等[5]研究發(fā)現(xiàn)，成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中有APJ受體及其配體apelin表達(dá)，且在分化過(guò)程表達(dá)水平呈動(dòng)態(tài)增高，證實(shí)了該信號(hào)通路也具有調(diào)節(jié)成體干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的作用。Li等[14]采用免疫熒光標(biāo)記及流式細(xì)胞分選技術(shù)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌梗死模型中，腹腔注射apelin-13可以使體內(nèi)具有心肌血管內(nèi)皮定向分化潛能的祖細(xì)胞群增加，并且造模2周后檢測(cè)到梗死區(qū)心肌面積縮小，毛細(xì)血管密度增加，心功能得到改善。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明apelin/ APJ信號(hào)通路無(wú)論對(duì)于胚胎干細(xì)胞還是成體干細(xì)胞定向心血管分化都有調(diào)控作用。

本研究結(jié)果顯示：在大鼠急性心肌梗死模型中，2周后檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組(心肌內(nèi)直接注射外源apelin-13蛋白)心肌梗死區(qū)面積較對(duì)照組(心肌內(nèi)直接注射生理鹽水)有所減小，心功能與之相比也有所改善，表明給予外源性apelin-13可降低心肌梗死面積，并能夠改善心臟功能，延緩心衰的進(jìn)展，從而對(duì)心肌梗死大鼠起到保護(hù)作用，與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相一致[2-4]。免疫組化檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組心肌組織C-kit、Flk1、Sca1染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多，呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性，而假手術(shù)組基本呈陰性，說(shuō)明冠脈結(jié)扎對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠CSCs產(chǎn)生了一定的刺激擴(kuò)增作用。Western blotting和RT-PCR檢測(cè)顯示，CSCs表面標(biāo)記物C-kit、Flk1、Sca1的蛋白和mRNA表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯增加，而假手術(shù)組心肌組織中C-kit、Flk1、Sca1蛋白表達(dá)為陰性，與免疫組化檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明給予外源性apelin-13可促進(jìn)CSCs的擴(kuò)增。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明給予外源性apelin-13對(duì)心肌梗死大鼠具有一定的保護(hù)作用，并且這種保護(hù)作用與刺激內(nèi)源心肌干細(xì)胞的分裂擴(kuò)增密切相關(guān)。

目前認(rèn)為應(yīng)用特殊效應(yīng)因子直接刺激動(dòng)員體內(nèi)CSCs較應(yīng)用心臟活檢組織體外分離、擴(kuò)增CSCs然后植入到受損心臟部位的策略更適于臨床，因?yàn)樗梢员苊饧?xì)胞植入途徑的選擇、植入細(xì)胞存活率低以及宿主免疫排斥等問(wèn)題[15]，且目前已有一些研究證實(shí)諸如HGF、IGF-1、FGF-2和EGF等生長(zhǎng)因子可影響CSCs的遷移、擴(kuò)增及分化能力[16-18]。本研究顯示apelin也可作為這樣一種特殊效應(yīng)因子，通過(guò)其分子機(jī)制及旁/自分泌效應(yīng)介導(dǎo)動(dòng)員體內(nèi)CSCs的擴(kuò)增。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，apelin作為成體干細(xì)胞定向心血管分化的調(diào)控因子，可以通過(guò)刺激體內(nèi)CSCs的分裂擴(kuò)增，達(dá)到促進(jìn)受損心肌再生和心臟結(jié)構(gòu)功能修復(fù)的目的。該結(jié)果既在整體水平上說(shuō)明apelin是調(diào)控成體干細(xì)胞定向心血管分化的關(guān)鍵因子，又為可操控性理論提供了新的依據(jù)。

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Effect of exogenous apelin-13 on cardiac stem cell mobilization in rats with myocardial infarction

ZHENG Nan1, ZHANG Ning-kun2, GAO Lian-ru2, XU Xiao-hong2, WANG Li2, ZHU Zhi-ming2*
1Heart Center of Naval Clinical Medical College, Second Military Medical University, Beijing 100048, China
2Department of Cardiology, Navy General Hospital, Beijing 100048, China
*

, E-mail: zhuzhiming6542@sina.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81170094)

ObjectiveTo explore the protective effect of exogenous apelin-13 on heart after acute myocardial infarction (AMI) in rats and its mechanism.MethodsSD rats were randomly divided into 3 groups: sham-operated group (n=6), control group (AMI + saline solution,n=12), experimental group (AMI + apelin-13,n=12). Four rats died in the control group, and five in the experimental group. The rest rats of both control and experimental groups underwent intramyocardial injection with saline solution 20μl and apelin-13 0.2μg/20μl within 5min after coronary artery ligation, respectively. The rats of sham-operated group underwent thoracic surgery without both coronary artery ligation and drug injection. Echocardiography was performed and myocardial infarct size was measured to evaluate the changes of cardiac function. Immunohistochemical staining method was used to detect the positive expression of C-kit, Flk1 and Sca1 in myocardial tissue. Western blotting and RT-PCR were used to quantitatively examine the expression levels of C-kit, Flk1 and Sca1 protein and mRNA in myocardial tissue.ResultsThe results of echocardiography and myocardial infarct size measurement showed that cardiac function of rats was improved more significantly in experimental group than in control group (EF: 68.43%±2.06% in experimental group and 46.40%±15.18% in control group; FS: 33.70%±1.55% in experimental group and 20.73%±8.14% in control group; infarction myocardial area percentage: 16.10%±3.08%in experimental group and 33.83%±5.64% in control group;P＜0.05). Immunohistochemical staining of C-kit, Flk1 and Sca1 was negative in sham-operated group and positive or strong positive both in experimental group and control group. Western blotting and RT-PCR showed that the protein and mRNA expression of C-kit, Flk1 and Sca1 were significantly higher in experimental group than in control group (protein level: C-kit 0.48±0.17vs1.05±0.08, Flk1 0.40±0.26vs0.88±0.10, Sca1 0.39±0.08vs0.70±0.08,P＜0.05; mRNA level: C-kit 2.89±1.89vs18.77±14.19, Flk1 2.14±0.95vs4.59±0.92, Sca1 4.32±2.44vs29.39±11.90,P＜0.05), and there was no obvious expression of C-kit, Flk1 or Sca1 protein in sham-operated group.ConclusionExogenous apelin-13 protein has protective effect on rats against myocardial infarction, which is closely related to stimulating the proliferation of endogenous cardiac stem cells.

apelin; cardiac stem cells; myocardial infarction

R329.28；R331.31

A

0577-7402(2013)10-0801-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.004

2013-06-04；

2013-07-15)

(責(zé)任編輯：張小利)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81170094)

鄭楠，主治醫(yī)師，碩士研究生。主要從事干細(xì)胞的基礎(chǔ)及臨床研究工作

100048 北京 第二軍醫(yī)大學(xué)海軍臨床醫(yī)學(xué)院心臟中心(鄭楠)；100048 北京 海軍總醫(yī)院心臟中心(張寧坤、高連如、徐小紅、王力、朱智明)

朱智明，E-mail：zhuzhiming6542@sina.com