周霞，王金川，蒲東全，行勇軍，安建平，劉魯川，鄧蔓菁

Fgfr2 S252W突變小鼠下頜切牙改變的研究

周霞，王金川，蒲東全，行勇軍，安建平，劉魯川，鄧蔓菁

目的對(duì)比野生型和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(Fgfr2)基因S252W突變型小鼠下頜切牙表型的差異，探討Fgfr2功能獲得性突變對(duì)小鼠下頜切牙的影響。方法將EⅡa-Cre雄鼠與Fgfr2S252W-neo/+雌鼠交配，子代獲得Fgfr2 S252W突變小鼠。在出生后56d(P56)取材進(jìn)行Micro-CT、HE染色及鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)檢測(cè)，分別檢測(cè)下頜切牙的大體形態(tài)、組織形態(tài)及牙齒礦化速率。結(jié)果新生突變小鼠即呈現(xiàn)出短顱畸形，56d時(shí)表現(xiàn)更為明顯，Micro-CT顯示突變小鼠的下頜切牙伸長(zhǎng)及反畸形明顯。HE染色顯示突變小鼠成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多，形態(tài)多不規(guī)則，內(nèi)釉上皮、外釉上皮形成的上皮隔皺縮。鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)檢測(cè)顯示突變小鼠牙本質(zhì)礦化生長(zhǎng)速率明顯高于對(duì)照小鼠。結(jié)論Fgfr2 S252W點(diǎn)突變對(duì)小鼠下頜切牙的伸長(zhǎng)及反畸形有一定促進(jìn)作用。

受體，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，2型；突變；切牙；小鼠

Apert綜合征為多顱縫早閉所致的綜合征，是一種少見(jiàn)的常染色體顯性遺傳疾病，主要由成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)gfr2)功能獲得性突變所致[1]，包括S252W和 P253R兩種突變，最早由法國(guó)神經(jīng)學(xué)家Apert于1906年報(bào)道而命名。其顱面部的臨床表現(xiàn)為顱縫早閉所致的頭顱畸形，突眼和中面部嚴(yán)重發(fā)育不良，此外還有嚴(yán)重的對(duì)稱性并指(趾)畸形[2-4]；中面部凹陷，腭蓋高拱，可有腭裂、牙列擁擠和開(kāi)，反畸形。Chen等[5]和Wang[6]等分別獨(dú)立報(bào)道了其建立了Fgfr2 S252W突變型小鼠模型，研究人員在研究Fgfr2 S252W點(diǎn)突變小鼠骨組織異常機(jī)制的同時(shí)，觀察到部分小鼠的牙齒特別是可以直視的下頜切牙伸長(zhǎng)、反，影響進(jìn)食。目前有關(guān)Fgfr2 S252W突變對(duì)骨組織生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控作用的研究較多[7-10]，而對(duì)牙發(fā)育及功能的影響研究甚少，其機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比觀察了Fgfr2 S252W突變型與野生型小鼠下頜切牙的表型差異，旨在探討Fgfr2 S252W點(diǎn)突變與小鼠下頜切牙異常的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 Fgfr2 S252W功能獲得性點(diǎn)突變小鼠的繁殖與鑒定 Fgfr2 S252W功能獲得性點(diǎn)突變小鼠從美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)引入后，將雌性帶neo基因+突變Fgfr2的基因工程小鼠和雄性EⅡa-Cre小鼠交配，在子代中獲得約1/4數(shù)量的Fgfr2 S252W功能獲得性突變小鼠。在納入實(shí)驗(yàn)前，提取小鼠腳趾DNA進(jìn)行PCR基因型鑒定，按照基因型分為對(duì)照型(+/+)和突變型(S252W/+)兩組。以上小鼠均在第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物室分籠飼養(yǎng)，給予12h:12h節(jié)律光照，室溫22℃，濕度50%～55%，自由進(jìn)食、飲水。經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)許可[執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)SYXK(軍2002032)]對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行操作。

1.2 基因型鑒定 提取小鼠腳趾基因組DNA，采用引物R2-I6F1：5'-TAGGTAGTCCATAACTCGG-3'和R2-7R2：5'-TTGATCCACTGGATGTGGGGC-3'鑒定Fgfr2 S252W點(diǎn)突變小鼠。使用rTaq PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為25μl。突變基因型為雙條帶(460bp和520bp)，對(duì)照組野生型為單條帶(460bp)。

1.3 出生后56d(P56)突變小鼠與同窩野生對(duì)照小鼠取材檢測(cè)

1.3.1 Micro-CT 本實(shí)驗(yàn)所用顯微CT為美國(guó)GE公司開(kāi)發(fā)的explore Locus SP型產(chǎn)品。掃描參數(shù)如下：電壓80kV，電流80μA，掃描方式360°旋轉(zhuǎn)，掃描時(shí)間270min，平均4幀，角度增益0.4°，曝光時(shí)間3000ms，分辨率7.0μm×7.0μm×7.0μm。以Flur方式進(jìn)行掃描，同時(shí)掃描標(biāo)準(zhǔn)體模，以備CT值校正。

1.3.2 HE染色 新鮮取材單側(cè)完整下頜骨(含牙)的組織經(jīng)4%多聚甲醛(PFA)4℃固定過(guò)夜，0.5mol/L EDTA脫鈣14～20d，流水沖洗過(guò)夜。梯度乙醇脫水(70%、80%、90%、100%、100%各1h)，二甲苯透明(2次各30min)。石蠟包埋，制備5μm切片，37℃干燥過(guò)夜。常規(guī)行HE染色。

1.3.3 鈣黃綠素(calcein)熒光雙標(biāo)檢測(cè)礦化沉積率(mineral apposition rate，MAR) 選取同窩突變型和野生型小鼠8對(duì)，P18和P23腹腔注射鈣黃綠素(25mg/kg，Sigma-Aldrich)。2d后處死小鼠，解剖分離包含牙列的單側(cè)完整下頜骨。系列乙醇4℃脫水，塑化劑溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ浸透包埋，至完全凝固。5μm冠狀切片，通過(guò)第一磨牙近中面，做持續(xù)萌出切牙的縱斷切面。熒光顯微鏡下觀察，拍片。激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)510nm。采用專業(yè)圖像分析軟件(Image-Pro Plus，IPP)計(jì)量分析2條熒光帶之間的平均距離，所得值除以標(biāo)記間隔日數(shù)即為MAR，單位為μm/d。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，正態(tài)分布的樣本數(shù)據(jù)兩組間比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 突變小鼠基因型鑒定結(jié)果 突變小鼠基因型鑒定電泳圖見(jiàn)圖1，雙條帶為突變基因型，單條帶為對(duì)照組野生型。

圖1 兩組小鼠基因型鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoregram of genotype identification of two groups of mice

2.2 小鼠大體觀察及Micro-CT頭顱側(cè)面觀 新生突變小鼠(1d)身材短小，呈現(xiàn)出短顱圓顱畸形；56d時(shí)，圓顱表現(xiàn)更為明顯，Micro-CT顯示突變小鼠下頜切牙伸長(zhǎng)及反畸形較為明顯(圖2)。

圖2 兩組小鼠大體觀察及Micro-CT頭顱側(cè)面觀Fig.2 General view and Micro-CT side view of head in two groups of mice

2.3 小鼠下頜切牙HE染色結(jié)果 HE染色顯示，對(duì)照小鼠成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞呈高柱狀，排列整齊，細(xì)胞核位于細(xì)胞基底部；突變小鼠成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多，形態(tài)多不規(guī)則，細(xì)胞核界限不清楚，無(wú)極性，排列紊亂，且突變小鼠下頜切牙頸環(huán)縮小，內(nèi)釉上皮、外釉上皮細(xì)胞及星網(wǎng)狀層細(xì)胞均減少，內(nèi)釉上皮、外釉上皮形成的上皮隔皺縮(圖3)。

圖3 兩組小鼠下頜切牙的HE染色結(jié)果(右側(cè)小圖為對(duì)應(yīng)左側(cè)局部放大圖)Fig.3 HE staining of mandibular incisors of two groups of mice

2.4 小鼠牙本質(zhì)熒光雙標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 鈣黃綠素?zé)晒怆p標(biāo)檢測(cè)顯示，突變小鼠與對(duì)照小鼠MAR分別為1.22±0.14μm/d、0.93±0.13μm/d，突變小鼠牙本質(zhì)礦化生長(zhǎng)速率明顯高于對(duì)照小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖4 兩組小鼠牙本質(zhì)熒光雙標(biāo)圖(P56)Fig.4 Double fluorescence labelling of dentin of two groups of mice

3 討 論

為克服Apert綜合征患者病例少，年齡、遺傳背景差異大，以及缺乏相似背景正常對(duì)照人群的不足之處，最早由Chen等[5]所在實(shí)驗(yàn)室用基因敲入技術(shù)建立了基于Cre-LoxP系統(tǒng)的模式動(dòng)物——模擬人Apert綜合征的小鼠模型(Fgfr2 S252W突變引起)。為了解該模型小鼠的頭顱發(fā)育畸形是否與人類Apert綜合征類似，杜曉蘭等[11]用客觀、定量的歐幾里得矩陣分析法(Euclidean distance matrix analysis，EDMA)分析了該小鼠的頭顱形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該Apert小鼠有穹隆狀頭顱、牙頜輕度前向錯(cuò)位、眼距增寬和面部發(fā)育不良等頭顱形態(tài)特征，表明該小鼠模型在頭顱形態(tài)結(jié)構(gòu)上較真實(shí)地模擬了人類Apert綜合征的頭顱表型特征。本實(shí)驗(yàn)按照Chen等[5]的方法繁殖的突變小鼠頭顱畸形也具有與人類Apert綜合征患者相似的頭顱表征，其中下頜切牙伸長(zhǎng)、反尤為明顯。

尹良軍等[12-13]對(duì)Fgfr2 S252W增強(qiáng)型點(diǎn)突變小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gfr2功能持續(xù)增強(qiáng)可能抑制未分化的間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞系的早期分化，但是促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化；突變型小鼠長(zhǎng)骨骨折愈合過(guò)程中，骨痂中軟骨組織形成的時(shí)間明顯延遲，軟骨組織鈣化、編織骨形成受阻，軟骨骨痂長(zhǎng)期存在，軟骨內(nèi)成骨受到抑制，從而導(dǎo)致骨骼發(fā)育過(guò)程中膜內(nèi)骨化過(guò)程異常和軟骨內(nèi)骨化過(guò)程受到抑制，這兩者的協(xié)同作用構(gòu)成了Apert綜合征多個(gè)重要骨骼異常體征的發(fā)病機(jī)制。由此可見(jiàn)，F(xiàn)gfr2 S252W突變通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的作用而抑制骨的生長(zhǎng)發(fā)育，但本實(shí)驗(yàn)觀察到的下頜切牙過(guò)度生長(zhǎng)也是突變的促進(jìn)作用所致。骨和牙同為機(jī)體硬組織，同一突變卻起到了相反的作用，其中的機(jī)制與聯(lián)系還有待進(jìn)一步深入研究。

以往研究顯示，在牙胚發(fā)育的蕾狀期、帽狀期、鐘狀期等，F(xiàn)GFs/FGFR2都發(fā)揮正常的調(diào)控作用，一旦FGFR2功能增強(qiáng)，失去平衡，勢(shì)必會(huì)影響牙齒的正常發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)中Fgfr2 S252W突變小鼠下頜切牙根尖上皮隔皺縮，根尖孔變大，血供營(yíng)養(yǎng)相對(duì)豐富，促進(jìn)前成牙本質(zhì)細(xì)胞、前成釉細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞分化，可能造成了HE染色結(jié)果中成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞數(shù)目增多以及大體觀察中突變小鼠下頜切牙生長(zhǎng)過(guò)快導(dǎo)致的伸長(zhǎng)及反現(xiàn)象，提示Fgfr2 S252W突變對(duì)小鼠下頜切牙的生長(zhǎng)期有調(diào)控作用，但對(duì)早期牙胚(蕾狀期、帽狀期、鐘狀期)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制如何，還有待進(jìn)一步研究。

建立疾病小鼠模型的目的是研究疾病發(fā)生機(jī)制及尋找治療措施。在前期研究中，Chen等[5]發(fā)現(xiàn)Fgfr2 S252W突變所致的Apert綜合征頭顱異常主要與顱骨成骨細(xì)胞分化、凋亡異常有關(guān)。理論上講，可以通過(guò)糾正這些異常來(lái)緩解Apert綜合征的顱骨發(fā)育畸形，但這些措施往往缺乏細(xì)胞靶向性，且有的措施如抑制細(xì)胞凋亡等因?yàn)榭赡艽嬖跐撛诘闹掳┬缘榷y以應(yīng)用。由于Apert綜合征的最根本原因是FGFR2突變后功能增強(qiáng)，提示只要降低或阻斷增強(qiáng)的FGFR2信號(hào)就可從源頭上消除病因，達(dá)到緩解或治療Apert綜合征切牙長(zhǎng)冠、反畸形的目的。2007年Shukla等[14]通過(guò)小鼠間交配將建立的針對(duì)Fgfr2 S252W突變的RNAi轉(zhuǎn)基因引入Fgfr2 S252W點(diǎn)突變小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該小鼠頭顱畸形基本消失。雖然該法是通過(guò)遺傳交配實(shí)現(xiàn)，在臨床上不可行，但其實(shí)驗(yàn)結(jié)果除提示可針對(duì)功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變所致遺傳病進(jìn)行RNAi治療外，也進(jìn)一步證明可通過(guò)降低FGFR2信號(hào)強(qiáng)度來(lái)緩解和治療Apert綜合征引起的頭顱畸形，下頜切牙伸長(zhǎng)及反畸形也可得到改善。

[1] Chen P, Zhang B, Zhang L,et al. Influence of gain-of-function mutation (Ser252Trp) in fibroblast growth factor receptor 2 gene on long bone development[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(7): 540-544. [陳鵬, 張波, 張莉, 等. FGFR2功能獲得性突變對(duì)長(zhǎng)骨發(fā)育過(guò)程的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(7): 540-544.]

[2] Oberoi S, Hoffman WY, Vargervik K. Craniofacial team management in Apert syndrome[J]. Am J Orthod Dentofacial Orthop, 2012, 141(4): S82-S87.

[3] Wakae H, Hanaoka K, Morishita T,et al. A clinical report on distraction osteogenesis applied for Apert syndrome[J]. Orthod Waves, 2008, 67(1): 30-37.

[4] Jeffrey CP, Paul ST, Ramon LR. Craniofacial dysostosis syndromes: evaluation and staged reconstructive approach[J]. Atlas Oral Maxillofac Surg Clin North Am, 2010, 18(2): 109-128.

[5] Chen L, Li D, Li C,et al. A Ser252Trp [corrected] substitution in mouse fibroblast growth factor receptor 2 (Fgfr2) results in craniosynostosis[J]. Bone, 2003, 33(2): 169-178.

[6] Wang Y, Xiao R, Yang F,et al. Abnormalities in cartilage and bone development in the Apert syndrome FGFR2 (+/S252W) mouse[J]. Development, 2005, 132(15): 3537-3548.

[7] Holmes G, Basilico C. Mesodermal expression of Fgfr2S252W is necessary and sufficient to induce craniosynostosis in a mouse model of Apert syndrome[J]. Dev Biol, 2012, 368(2): 283-293.

[8] Holmes G, Rothschild G, Roy UB,et al. Early onset of craniosynostosis in an Apert mouse model reveals critical features of this pathology[J]. Dev Biol, 2009, 328(2): 273-284.

[9] Yang F, Wang YL, Zhang ZJ,et al. The study of abnormal bone development in the Apert syndrome Fgfr2+/S252W mouse using a 3D hydrogel culture model[J]. Bone, 2008, 43(1): 55-63.

[10] Du X, Weng T, Sun Q,et al. Dynamic morphological changes in the skulls of mice mimicking human Apert syndrome resulting from gain-of-function mutation of FGFR2 (P253R)[J]. J Anat, 2010, 217(2): 97-105.

[11] Du XL, Chen Z, Yin LJ,et al. Skull morphology of mice carrying gain-of-function mutation of FGFR2 Ser252Trp by Euclidean distance matrix analysis[J]. Acta Acad Med Militaris Tertiae, 2009, 31(8): 655-658. [杜曉蘭, 陳志, 尹良軍, 等. 歐幾里德幾何距離矩陣法對(duì)FGFR2 Ser252Trp點(diǎn)突變小鼠頭顱形狀特征的分析[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 31(8): 655-658.]

[12] Yin L, Du X, Li C,et al. A Pro253Arg mutation in fibroblast growth factor receptor 2 (Fgfr2) causes skeleton malformation mimicking human Apert syndrome by affecting both chondrogenesis and osteogenesis[J]. Bone, 2008, 42(4): 631-643.

[13] Yin LJ, Du XL, Liu ZJ,et al. Fibroblast growth factor type Ⅱreceptor mutation affects the development of bone marrow stromalcells in mice[J]. J Clin Rehabil Tissue Eng Res, 2007, 11(24): 4768-4772. [尹良軍, 杜曉蘭, 劉志君, 等. 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子Ⅱ型受體基因突變對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2007, 11(24): 4768-4772.]

[14] Shukla V, Coumoul X, Wang RH,et al. RNA interference and inhibition of MEK-ERK signaling prevent abnormal skeletal phenotypes in a mouse model of craniosynostosis[J]. Nat Genet, 2007, 39(9): 1145-1150.

Changes of mandibular incisor in Fgfr2 S252W mutant mice

ZHOU Xia1, WANG Jin-chuan1, PU Dong-quan2, XING Yong-jun1, AN Jian-ping1, LIU Lu-chuan1, DENG Man-jing1*
1Department of Stomatology, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
2Medical Team, The No.77289 Army of PLA, Kunming 650225, China
*

, E-mail: iradeng@163.com
This work was supported by the Natural Science Foundation Project of Chongqing (2009AC5019, 2011BA5013)

ObjectiveTo compare the phenotypic differences of mandibular incisor between the wild-type mice and fibroblast growth factor receptor 2 (Fgfr2) gene S252W mutant mice, and explore the influence of gain-of-function mutation in Fgfr2 gene on mandibular incisors in mice.MethodsThe male EⅡa-Cre mice were mated with Fgfr2S252W-neo/+females to obtain the Fgfr2 S252W mutant mice. On the 56th day after offspring's birth (P56), samples were taken for Micro-CT, HE staining and calcein double fluorescent labeling to observe the gross appearance, tissue morphology and mineral apposition rate of mandibular incisors, respectively.ResultsThe newborn mutant mice showed short cranial deformity, which became more obvious on P56. Micro-CT showed a significant elongation and cross-bite deformity of mandibular incisors. HE staining showed that there were more ameloblasts and odontoblasts in the mutant mice, mostly with irregular appearance; epithelial diaphragm composed of inner and outer enamel epithelium shrank. Calcein double fluorescent labeling showed that the mineral apposition rate of dentin in mutant mice was significantly higher than that in controls.ConclusionFgfr2 S252W mutation accelerates the growth of mandibular incisors in mice, resulting in the elongation and cross-bite deformity of mandibular incisors.

receptor, fibroblast growth factor, type 2; mutation; incisor; mice

R780.2

A

0577-7402(2013)10-0807-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.005

2013-03-15；

2013-07-13)

(責(zé)任編輯：張小利)

重慶市自然科學(xué)基金(2009AC5019，2011BA5013)

周霞，醫(yī)學(xué)博士。主要從事牙體牙髓牙周病的研究

400042 重慶 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所口腔科(周霞、王金川、行勇軍、安建平、劉魯川、鄧蔓菁)；650225 昆明 解放軍77289部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)(蒲東全)

鄧蔓菁，E-mail：iradeng@163.com