王春梅，薛曉鷗，張廣美

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，中西醫(yī)結(jié)合博士后流動(dòng)站，北京 100700;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700;3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

卵巢癌是惡性度及致死率最高的婦科腫瘤［1］，五年生存率不到45%。以鉑類(lèi)為主的化學(xué)治療為其主要的治療手段之一。雖然鉑類(lèi)初始使用臨床效果顯著，但隨療程的增加，腫瘤細(xì)胞逐漸對(duì)其產(chǎn)生耐受性［2］，鉑類(lèi)耐藥成為影響卵巢癌化療療效及患者預(yù)后的主要因素。因此，尋求一種增強(qiáng)鉑類(lèi)化療效果或降低鉑類(lèi)耐藥的方法十分重要。

遼東楤木(Aralia elata(Miq.)Seem)，是東北地區(qū)餐桌上常見(jiàn)的山野菜，為五加科楤木屬多年生亞喬木植物，又名龍牙楤木、刺嫩芽、刺老芽等。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有補(bǔ)腎填精的功效。在前期的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在遼東楤木葉中提取的皂苷類(lèi)物質(zhì)可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞及卵巢癌耐順鉑株SKOV3－DDP細(xì)胞的生長(zhǎng)［3］，并能夠降低耐藥蛋白的表達(dá)［4］。本課題旨在探討遼東楤木葉總皂苷(Total aralosides isolated from the leaves of Aralia elata(Miq.)Seem ，TALAS)是否具有協(xié)同順鉑、抑制SKOV3－DDP細(xì)胞生長(zhǎng)的作用并探尋其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系及培養(yǎng)方法 卵巢腺癌順鉑耐藥株(SKOV3－DDP，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所，批號(hào)zk－2010)。培養(yǎng)條件:細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(NQBB，澳大利亞)的RPMI－1640培養(yǎng)液中，其中加入0.1%青 － 鏈霉素、0.3%谷氨酰胺，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3天傳一代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 遼東楤木葉總皂苷(TALAS)，粉末狀、褐色、易溶于水，常溫保存，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室匡海學(xué)教授2010年贈(zèng)送，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液配成1 000ug/ml母液，－20℃保存，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求配成相應(yīng)濃度;順鉑(齊魯制藥，批號(hào)990619)，用生理鹽水配成液體，4℃保存;RPMI－1640培養(yǎng)液(HyClone，美國(guó));胎牛血清(NQBB，澳大利亞);蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(江蘇碧云天);Annexin－V FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天);Phospho－iκB －α(Ser32)抗體(CST，美國(guó));Phospho－iκκα(Ser176)(CST，美國(guó));Phospho－ NF －κBp65(Ser536)(CST，美國(guó));內(nèi)參 β －actin、馬抗小鼠二抗、羊抗兔二抗(SANTA CRUZ，美國(guó));MTT、DMSO、PI、RNase A(Sigmal，美國(guó));PCR 引物(上海生工，內(nèi)參 GAPDH:上游:5'－ gtcagtggtggacctgacct－3'、下游5'－ aggggtctacatggcaactg － 3'，LRP(lung resistance protein)5'－acaagacccgtgtggttagc－3'、下游:5'－agagggacaacacggtgaac－3');RT－PCR反應(yīng)試劑盒(大連寶生物)。

1.3 實(shí)驗(yàn)耗材及儀器設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、槍頭等耗材(corning，美國(guó));DYY－12型電泳儀(北京六一儀器廠);GDS－8000凝膠成像儀(UVP，美國(guó));流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó));多功能酶標(biāo)儀(Biotek，美國(guó));熒光倒置顯微鏡(德國(guó)蔡司Zeiss公司);紫外分光光度計(jì)(島津，日本);逆轉(zhuǎn)錄－PCR反應(yīng)儀(百維信生物);藍(lán)盾552可見(jiàn)光凝膠電泳透射儀(廈門(mén)百維信生物)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)TALAS、順鉑對(duì) SKOV3－DDP細(xì)胞的協(xié)同抑制作用

在前期實(shí)驗(yàn)中，已通過(guò)MTT法證實(shí)TALAS對(duì)SKOV3－DDP細(xì)胞的抑制作用，在本實(shí)驗(yàn)中仍采用MTT法檢測(cè)TALAS與順鉑在抑制耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)中的協(xié)同作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3－DDP細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，分為順鉑組(50umol/l)、TALAS(100ug/ml)組、順鉑 +TALAS組(50umol/l+100ug/ml)、陰性對(duì)照組(培養(yǎng)液)，每組設(shè)五個(gè)復(fù)孔，周邊孔用PBS填補(bǔ)。37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，吸盡液體，PBS沖洗后，每孔加入300ul液體，混合藥液組兩種藥液各加入150ul，培養(yǎng)24h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，根據(jù)公式計(jì)算抑制率。

2.2 Annexin－V FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3－DDP細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算濃度。以3×105個(gè)/孔，種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2ml完全培養(yǎng)液，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將細(xì)胞分為對(duì)照組、TALAS低劑量組(50ug/ml)、TALAS中劑量組(100ug/ml)、TALAS高劑量組(200ug/ml)。吸出上清液，根據(jù)分組加入不同濃度藥液各2ml，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。Annexin－V FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡(按說(shuō)明操作)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。凋亡率用(mean±SEM)表示，組間比較用t檢驗(yàn)，用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為具有顯著性差異。

2.3 RT－PCR檢測(cè)LRP mRNA表達(dá)

細(xì)胞處理及實(shí)驗(yàn)分組同上，收集各組細(xì)胞，提取總RNA，根據(jù)引物及反應(yīng)條件逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈觀察凝膠并照相，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，條帶分析軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4 WB法檢測(cè)NF－B信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白質(zhì)磷酸化水平

細(xì)胞培養(yǎng)、藥物干預(yù)及分組同上實(shí)驗(yàn)，收集各組細(xì)胞，磷酸化蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞蛋白質(zhì)，檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，計(jì)算上樣量，經(jīng)過(guò)聚丙烯胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜等過(guò)程，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至NC膜上，然后進(jìn)行免疫反應(yīng)。一抗稀釋濃度:Phospho－iκB－α(Ser32)抗體:抗體稀釋液 =1∶800，Phospho － iκκα:抗體稀釋液 =1∶1 000，Phospho－NF －κB:抗體稀釋液 =1∶750，渦旋混勻。內(nèi)參β－actin:抗體稀釋液=1∶500。馬抗小鼠二抗稀釋濃度為1∶500，羊抗兔二抗稀釋濃度為1∶1 000。免疫反應(yīng)后，堿酶法顯影、定影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，照相并分析結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 TALAS、順鉑抑制SKOV3－DDP細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同作用

經(jīng)過(guò)24h的作用后，順鉑組(50umol/l)細(xì)胞抑制率達(dá)到(54.37 ±1.27)%，TALAS 組(100ug/l)抑制率為(45.67±2.34)%，順鉑 +TALAS(69.26±2.34)%。結(jié)果顯示，TALAS與順鉑有明顯的協(xié)同作用，可增強(qiáng)順鉑對(duì)SKOV3－DDP細(xì)胞的抑制作用。

3.2 Annexin－V FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用Annexin－V FITC/PI雙染法檢測(cè)TALAS誘導(dǎo)SKOV3－DDP細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用，結(jié)果如圖1A所示:正常對(duì)照組早期凋亡的細(xì)胞僅占細(xì)胞總數(shù)的(0.85±0.13)%;TALAS低劑量組作用24h后，早期凋亡細(xì)胞的比率上升到(8.1±0.34)%;TALAS中劑量組及高劑量組早期凋亡細(xì)胞含量進(jìn)一步上升，分別為(14.9 ±0.85)%、(28.7 ±0.45)%。如圖1B 所示:與正常組相比，中、高劑量組早期凋亡率具有顯著性差異(P ＜0.05，P ＜0.01)。

3.3 TALAS對(duì)LRP mRNA水平的影響 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 TALAS對(duì)LRP RNA水平的影響(mean±SEM，n=3)

如圖2所示，左側(cè)為內(nèi)參GAPDH組，右側(cè)為L(zhǎng)RP組，從左至右分別為對(duì)照組、TALAS低劑量組(50ug/ml)、中劑量組(100ug/ml)、高劑量組(200ug/ml)，分別作用24h后，細(xì)胞內(nèi)LRP及內(nèi)參GADPH的表達(dá)情況，條帶灰度代表mRNA表達(dá)水平的高低。如表1所示:將對(duì)照組灰度設(shè)置為1，其他各組為相對(duì)于正常組的灰度值，將各組條帶灰度值與相應(yīng)組內(nèi)參GADPH的灰度值相比，結(jié)果如表1所示:與對(duì)照組相比，高濃度組差異顯著(P＜0.05)，低濃度、中濃度組無(wú)顯著性差異。

3.4 WB法檢測(cè)NF－κB信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白質(zhì)磷酸化水平 結(jié)果見(jiàn)圖3、表2。

表2 TALAS 對(duì) Phospho－iκB － α、Phospho－ iκκα、Phospho－NF－κB蛋白質(zhì)表達(dá)的影響(mean±SEM，n=3)

圖1 Annexin－V FITC/PI雙染法檢測(cè)不同濃度TALAS作用24h后早期凋亡率的變化

圖2 RT－PCR法檢測(cè)TALAS對(duì)SKOV3－DDP細(xì)胞LRP mRNA水平表達(dá)的影響

圖3 WB 法檢測(cè) TALAS對(duì) Phospho－iκB － α、Phosphoiκκα、Phosphoκ －NF － κB 蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響

如圖3所示，從左至右為正常細(xì)胞對(duì)照組、TALAS低劑量組(50ug/ml)、中劑量組(100ug/ml)、高劑量組(200ug/ml)分別作用于SKOV3－DDP細(xì)胞24h后，Phospho－iκκB － α、Phospho－iκκα、Phospho－NF － κB及內(nèi)參β－actin蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，條帶灰度代表蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

如表2所示，將正常組的灰度值設(shè)置為1，其他各組為相對(duì)灰度值，與正常組相比，中濃度組及高濃度組P－iκB－α表達(dá)水平顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P ＜0.01);高濃度組 P －iκκα、P －NF － κB 表達(dá)水平下調(diào)，與正常組相比具有顯著性差異(P＜0.01)，低、中劑量組與正常組相比差異不顯著(P＞0.05)。

4 討論

鉑類(lèi)耐藥是卵巢癌治療過(guò)程中的嚴(yán)重問(wèn)題，解決鉑類(lèi)耐藥對(duì)于卵巢癌患者意義重大。順鉑是一種中性的、正方形Pt(CN)配合物，含有兩個(gè)氯離子配體并處于順位。其主要作用機(jī)制是對(duì)DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄的抑制，并阻礙細(xì)胞停滯于G2期，誘導(dǎo)其凋亡。任何影響順鉑加合物形成和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的因素都可以影響對(duì)順鉑的耐藥性。如有報(bào)道說(shuō)，胞內(nèi)蛋白的失活作用能夠?qū)е录?xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性［5－6］，另外，藥物的攝取和流出異常與順鉑的耐藥性也密切相關(guān)，在耐順鉑的細(xì)胞株中，通?？梢杂^察到藥物蓄積降低的現(xiàn)象。某些癌基因與抑癌基因表達(dá)的突變與細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性有有一定關(guān)系，因?yàn)檫@些基因表達(dá)的突變可以引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的改變［7－11］，促使凋亡機(jī)制發(fā)生異常，或抑制凋亡通路活性。

通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)，我們已經(jīng)證實(shí)了TALAS對(duì)SKOV3細(xì)胞及SKOV3－DDP細(xì)胞的抑制作用，但未探討其與順鉑的協(xié)同作用［12］。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TALAS與順鉑協(xié)同應(yīng)用效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用，證明二者具有明顯的協(xié)同作用。而通過(guò)Annexin－V FITC/PI雙染法，進(jìn)一步證實(shí)了TALAS誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用，提示二者的協(xié)同作用可能與TALAS的促凋亡作用相關(guān)。肺耐藥相關(guān)蛋白(lung resistance protein，LRP)被認(rèn)為是人類(lèi)的主要穹窿蛋白，分布于胞漿內(nèi)或核膜上，可通過(guò)胞吐機(jī)制將藥物排出細(xì)胞，從而減少了藥物在細(xì)胞內(nèi)的積聚。其底物非常廣泛，包括鉑類(lèi)和烷化劑類(lèi)藥物。通過(guò)RT－PCR法檢測(cè)TALAS對(duì)LRP mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度組TALAS可明顯下調(diào)其表達(dá)水平。因此，TALAS與順鉑的協(xié)同作用可能與其能夠抑制LRP的表達(dá)相關(guān)。

信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常也是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的重要因素，因其網(wǎng)絡(luò)性、交叉性，可通過(guò)多種直接、間接的渠道影響腫瘤細(xì)胞耐藥。NF－κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，包括5個(gè)亞型，主要涉及人體防御反應(yīng)、組織損傷、細(xì)胞分化和凋亡及腫瘤生長(zhǎng)抑制過(guò)程中的信息傳遞。在大多數(shù)細(xì)胞中，NF－κB可以通過(guò)上調(diào)促細(xì)胞存活基因和凋亡抑制基因的表達(dá)，來(lái)保護(hù)細(xì)胞免于凋亡［13］。因NF－κB對(duì)維持細(xì)胞抵抗腫瘤壞死因子(TNF)的殺傷起著關(guān)鍵性作用［14］，而推測(cè)NF－κB的抑制凋亡作用可能是通過(guò)腫瘤壞死因子受體－1介導(dǎo)的。很多證據(jù)顯示，NF－κB與腫瘤多藥耐藥密切相關(guān)，并且可能從多方面涉及多藥耐藥性的發(fā)生、發(fā)展和形成［15－16］，可在各種刺激尤其是化療藥物的作用下高表達(dá)，并抵抗化療藥物的促凋亡作用。NF－κB信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平與其活性密切相關(guān)，在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)WB法，發(fā)現(xiàn)TALAS可下調(diào)其關(guān)鍵蛋白磷酸化水平，抑制NF－κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性。因此，推測(cè)TALAS與順鉑的協(xié)同作用可能與其誘導(dǎo)凋亡及降低耐藥蛋白表達(dá)有關(guān)，而此作用可能是通過(guò)抑制NF－κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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