胡春紅，胡靈衛(wèi)，紀秀娥，朱自學，古紅梅，肖艷華

1(周口師范學院 生命科學與農學學院，河南 周口，466001)2(商丘醫(yī)學高等專科學校 基礎醫(yī)學部，河南 商丘，476100)

面包、饅頭等富含淀粉質的食物易于被霉菌特別是匍枝根霉污染，導致食物霉變，造成大量的經濟損失。相關文獻研究表明，一些天然植物提取物［1-2］、或化學物質［3-4］、或生物抗菌劑［5-7］等對霉菌均具有較強的抑制作用。但這些殺菌劑往往存在這樣或那樣的缺點，如不易獲取、價格昂貴、耐藥性、二次污染、穩(wěn)定性差等。因此，尋找一種安全、經濟、方便的面包根霉殺菌劑更符合實際需要。

山梨酸(鉀)是一種不飽和脂肪酸(鹽)，在人體內可分解為二氧化碳和水，無殘留，安全性好，是聯(lián)合國糧農組織和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合向世界各國推薦的食品防腐劑;再加上其價格低廉及具有廣普的抑菌效果，因而在食品加工中被廣泛應用。本研究以匍枝根霉孢子為實驗對象，以山梨酸鉀為實驗材料，研究不同濃度山梨酸鉀對根霉孢子萌發(fā)及菌絲生長的抑制作用，同時還改良了根霉固體培養(yǎng)法，以其為食品等行業(yè)產品的防腐提供一定的理論依據(jù)，并為相關科研提供一定的技術方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

匍枝根霉(Rhizopus stolonifer Vuill )菌種，從發(fā)霉的面包上提取純化獲得。

山梨酸鉀，購于天津市某化學有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

參考相關資料［8］，分別配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)液體和固體培養(yǎng)基(pH:7.2)，高壓滅菌后，備用。

1.2.2 倒平板

精確稱取一定量山梨酸鉀，置上述PDA 液體培養(yǎng)基內，搖勻，配制成含不同濃度的山梨酸鉀(0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/100 mL)的PDA 液體培養(yǎng)基。同法，配制含上述相同濃度梯度的山梨酸鉀的PDA 固體培養(yǎng)基，并分別倒入無菌培養(yǎng)皿中，并標記為1 ～7 號，每一濃度做3 個平行。

另取標準濾紙分別沾取少量上述含不同濃度的山梨酸鉀的液體培養(yǎng)基，貼在上述對應標號(1 ～7號)的培養(yǎng)皿皿蓋內，同樣方法，再在上面沾一層玻璃紙，蓋上皿蓋，置超凈工作臺內，備用。

1.2.3 菌種活化

取匍枝根霉的凍干管在無菌操作臺內打開，用移液槍吸取少量的PDA 液體培養(yǎng)基(不含山梨酸鉀)注入凍干管內，搖勻，制備菌懸液。用移液槍吸取少量置于PDA 固體培養(yǎng)基(不含山梨酸鉀)上，并用涂布棒涂布均勻，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，如此反復培養(yǎng)菌種3 代，制得活化的根霉。

1.2.4 孢子懸浮液的制備

由于根霉的菌絲較長，長出的孢子部分落到培養(yǎng)皿蓋上。在無菌操作臺內，用適量的無菌水沖洗培養(yǎng)皿蓋內的孢子，輕輕搖勻后，用移液管吸取1 mL 放入無菌的200 mL 三角瓶內，并進行逐級稀釋，同時對每個梯度的菌懸液進行平板菌落計數(shù)，直至獲得合適稀釋度的孢子懸液(孢子懸液濃度:3.0 × 102CFU/mL)。

1.2.5 接種與培養(yǎng)

采用無菌操作，用移液槍分別吸取上述孢子懸液0.4 mL，接種到上述1 ～7 號PDA 固體培養(yǎng)基上，并涂布均勻，28 ℃培養(yǎng)1 d。觀察并統(tǒng)計根霉孢子萌發(fā)情況。然后把平皿倒置培養(yǎng)2 ～3 d，待玻璃紙上布滿根霉菌絲后，便可以用于菌絲進一步觀察研究。

1.2.6 抑菌測定方法

于上述1 ～7 號培養(yǎng)皿蓋上，分別剪取一小塊長菌絲的玻璃紙，貼在載玻片上，滴1 ～2 滴乳酸石碳酸棉染色液，制成臨時裝片，置于電鏡下觀察菌絲的生長情況，并記錄數(shù)據(jù)和拍照。通過肉眼觀察并記錄培養(yǎng)皿底內菌落的生長及色澤變化情況等。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

運用SPSS16.0 統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

3.1 不同濃度的山梨酸鉀對根霉孢子萌發(fā)的影響

由圖1 可知，山梨酸鉀對根霉孢子的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，且濃度越大，抑制效果越顯著，當濃度為1.2 g/100 mL 時，抑制孢子萌發(fā)的程度可達90%。

圖1 山梨酸鉀對根霉孢子萌發(fā)情況的影響Fig.1 The influence of potassium sorbate on spore germination of Rhizopus Stolonifer Vuill

3.2 不同濃度的山梨酸鉀對根霉菌落形態(tài)的影響

山梨酸鉀不僅對根霉孢子的萌發(fā)具有抑制作用，而且影響根霉早期菌落的形態(tài)和大小。用肉眼及放大鏡觀察發(fā)現(xiàn)，根霉孢子萌發(fā)具有顯著的時間效應:隨山梨酸鉀濃度增加，孢子萌發(fā)速度減慢;當山梨酸鉀濃度在0.4 ～0.8 g/100 mL 時，根霉早期菌落(培養(yǎng)1 ～2 d 時的菌落)明顯較小，而且由近圓形開始變成不規(guī)則形狀，且逐漸裂解;當濃度達到1.0 ～1.2 g/100 mL 時抑制作用更明顯，幾乎無早期菌落長出。隨培養(yǎng)時間延長，各濃度下均有菌落長出。選擇3 ～6 d 內培養(yǎng)的根霉菌落，對其顏色、形態(tài)進行觀察和拍照，見圖2;用數(shù)碼測微尺測量菌落高度，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計分析和作圖，見圖3。

圖2 山梨酸鉀作用下根霉菌落形態(tài)特征(圖中“%”代表“g/100mL”)Fig.2 Morphological characteristics of Rhizopus stolonifer Vuill colony under potassium sorbate

由圖2 知，隨山梨酸鉀濃度增加，菌落直徑均在逐漸減小，根霉菌落的顏色逐漸由白色變成黑色。說明，山梨酸鉀抑制根霉菌絲生長并加速其老化衰退，濃度越大，抑制作用越強。

由圖3 知，隨山梨酸鉀濃度增加，根霉菌落高度逐漸降低，當山梨酸鉀濃度≥0.8 g/100 mL 時，差異達到顯著水平(P ＜0.05)。由圖3 還可以看出，隨培養(yǎng)時間延長，各濃度下菌落高度每天增加的數(shù)量逐漸降低。這說明，濃度越高，菌絲生長速度越慢，并且山梨酸鉀的抑菌效果在短時間內(6 d)有隨時間延長而增強的趨勢。

圖3 山梨酸鉀對根霉菌落高度影響的時效性Fig.3 Time-effectiveness of potassium sorbate on colony height of Rhizopus stolonifer Vuill

3.3 不同濃度的山梨酸鉀對根霉菌絲生長的影響

在培養(yǎng)根霉3 ～6 d 內，每天進行取樣和制作裝片，在顯微鏡(10 ×10)下進行觀察和拍照，并用目鏡測微尺測量菌絲直徑，結果見表1 及圖4(菌絲照片)。

表1 山梨酸鉀對根霉菌絲直徑影響的時效性Table 1 Time-effectiveness of potassium sorbate on the diameter of Rhizopus hyphae

圖4 山梨酸鉀作用下根霉菌絲形態(tài)觀察(圖中“%”代表“g/100mL”)Fig.4 Morphological characteristics of Rhizopus hyphae under potassium sorbate

由表1 及圖4 知，隨著山梨酸鉀濃度的增加，根霉的菌絲逐漸變細而彎曲;孢子囊的體積逐漸變小，囊中的孢子數(shù)量明顯減少。

3 討論與結論

實驗結果表明:山梨酸鉀對匍枝根霉孢子萌發(fā)和菌落生長均具有明顯的抑制作用，甚至加速菌落老化而衰退，且隨著山梨酸鉀濃度增加這種抑制作用增強。當山梨酸鉀濃度為0.8 g/100 mL 時，抑制作用達到差異顯著水平，當濃度達到1.2 g/100 mL 時，90%的孢子均不能萌發(fā)。分析其抑制作用的機理，認為可能是因為山梨酸鉀的主要有效成分是山梨酸，易溶于有機溶劑及醇類物質;而角固醇特別是麥角甾醇是真菌細胞膜的重要組成成份，對確保細胞膜的完整性，膜結合酶的活性，膜的流動性，細胞活力以及細胞物質運輸?shù)绕鹬匾饔?山梨酸鉀的溶解性使其可順利穿透細胞膜進入細胞體內，破壞各種膜系統(tǒng)的通透性及干擾膜其他正常生理功能，從而起到抑制真菌生長的作用。另有相關研究報道，許多化學物質或天然植物提取物均可降低麥角甾醇的生物合成及質膜中麥角甾醇的含量，破壞質膜的完整性，并造成氧化損傷，使大量活性氧積累，從而啟動氧化損傷式細胞凋亡程序［1，9-10］。本研究結果中山梨酸鉀加速菌落老化衰退現(xiàn)象與前人已有相關研究一致。

山梨酸鉀屬酸性防腐劑，在酸性條件下，對細菌、酵母和霉菌均有明顯的抑制作用，抑菌最適pH 值低于5.0 ～6.0［13-14］。而該實驗所配制的PDA 培養(yǎng)基其pH 值為7.2，在pH 值近乎中性的環(huán)境下山梨酸鉀依然表現(xiàn)出了較強的抑菌效果，并且隨著培養(yǎng)時間延長，各濃度下菌絲的生長速度減慢，且山梨酸鉀濃度越高，抑菌效果增強的趨勢越明顯。這可能是因為較高濃度的山梨酸鉀顯著降低了細胞膜中麥角甾醇含量，嚴重破壞了質膜的完整性，造成微生物代謝產生的大量酸性物質外泄，改變了培養(yǎng)基的環(huán)境，從而進一步增強了山梨酸鉀的抑菌效果，形成良好的抑菌循環(huán)。因此，該實驗結果為日常生活、生產中一些物品要求pH 值中性條件下防腐提供參考，也為擴大山梨酸鉀的應用范圍提供一定的理論資料。綜上所述，山梨酸鉀是一種更為安全、經濟、方便而有效的匍枝根霉殺菌劑。

另外，本實驗采用皿蓋上貼濾紙和玻璃紙的方法培養(yǎng)真菌，可以觀察到原生態(tài)的菌絲生長情況，并且操作簡單而方便，該方法可為相關領域的科研和教學提供一定的技術資料。

［1］ Tian J，Ban X Q，Zeng H，et al. The mechanism of antifungal action of essential oil from dill (Anethum graveolens L.)on Aspergillus flavus［J］.PLoS ONE，2012，7(1):e30 147.

［2］ Krishnamurthy Y L，Shashikala J. Inhibition of aflatoxin B1 production of Aspergillus flavus，isolated from soybean seeds by certain natural plant products［J］.Letters in Applied Microbiology，2006，43(5):469 -474.

［3］ Nesci A，Rodriguez M，Etcheverry M. Control of Aspergillus growth and aflatoxin production using antioxidants at different conditions of water activity and pH［J］.Journal of Applied Microbiology，2003，95(2):279 -287.

［4］ Passone M A，Resnik S L，Etcheverry M G. In vitro effect of phenolic antioxidants on germination，growth and aflatoxin B1 accumulation by peanut Aspergillus section Flavi［J］.Journal of Applied Microbiology，2005，99(3):682 -691.

［5］ 周啟升，孫長坡，張楠，等. 拮抗放線菌$24 的鑒定及其對黃曲霉的抑制作用［J］. 微生物學通報，2009，36(12):1 832 -1 837.

［6］ 邱并生. 利用拮抗物生物防治黃曲霉毒素［J］. 微生物學通報，2011，38(11):1 747.

［7］ 高雅，丁文，張琦，等. 傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣中產毒黃曲霉高效拮抗菌的篩選［J］. 微生物學通報，2010，37(3):369 -374.

［8］ 劉國生. 微生物學實驗技術［M］. 北京:科學出版社，2007:58，84 -87，125.

［9］ Arthington Skaggs B A，Lee-Yang W，Ciblak M A，et al.Comparison of visual and spectrophotometric methods of broth microdilution MIC end point determination and evaluation of a sterol quantitation method for in vitro susceptibility testing of fluconazole and itraconazole against trailing and nontrailing Candida isolates［J］. Antimicrob Agents Chemother，2002，46(8):2 477 -2 481.

［10］ Arthington Skaggs B A，Warnock D W，Morrison C J.Quantitation of Candida albicans ergosterol content improves the correlation between in vitro antifungal susceptibility test results and in vivo outcome after fluconazole treatment in a murine model of invasive candidiasis［J］. Antimicrob Agents Chemother，2000，44(8):2 081-2 085.

［11］胡春紅，葛紅蓮，李季平，等. 苯甲酸鈉和山梨酸鉀對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的影響［J］. 食品工業(yè)科技，2011，32(4):180 -181.

［12］羅傲霜，淳澤，羅傲雪，等. 食品防腐劑的概況與發(fā)展［J］. 中國食品添加劑，2005(4):55 -58.