林初文

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征（PRDC）是危害當(dāng)前世界養(yǎng)豬業(yè)的一種重要疾?。?］，豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）和及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）被認(rèn)為是PRDC的病原體［2］。

PRRSV自1987年首次發(fā)現(xiàn)以來，已遍及世界各個(gè)養(yǎng)豬國家，給養(yǎng)豬業(yè)造成了災(zāi)難性的打擊［3-5］。PCV-2呈現(xiàn)全球性流行［6］，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失［7-8］。豬場(chǎng)經(jīng)常發(fā)生PCV-2和PRRSV混合感染的現(xiàn)象，混合感染常常加重疫情，增加死亡率［9］。

目前，對(duì)豬圓環(huán)病毒?。≒CVD）的預(yù)防還沒有很好的疫苗，預(yù)防接種和綜合防控相結(jié)合的方法是防控豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的主要措施，弱毒苗以及滅活苗在PRRS的防控上盡管起到了一些作用，但不能杜絕PRRS的發(fā)生，因此各國都在研制PCVD和PRRS新型疫苗。PRRSV GP5基因編碼病毒的糖基化囊膜蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，因此很多PRRS新型疫苗均以GP5為靶抗原［10-11］。PCV-2ORF2基因編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap是主要的抗原蛋白［12］。以腺病毒作為表達(dá)載體，研制的新型基因工程疫苗有非常好的應(yīng)用前景，腺病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的基因具有病毒滴度高、感染細(xì)胞譜廣、轉(zhuǎn)移效率高、容易濃縮和貯存等很多優(yōu)點(diǎn)［13］。研究表明，構(gòu)建的豬瘟重組腺病毒［14］和西方馬腦炎重組腺病毒［15］均具有良好的免疫效果。

本研究成功構(gòu)建了表達(dá)PCV-2ORF2和PRRSV GP5基因的重組腺病毒rAd-gio，將其免疫小鼠，通過ELISA、病毒中和試驗(yàn)，測(cè)定小鼠的體液免疫水平，為PCV-2和PRRSV重組腺病毒二聯(lián)基因工程苗的成功研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

293A細(xì)胞，PK-15細(xì)胞，Marc-145細(xì)胞，DH5α感受態(tài)細(xì)胞，含AdEasy-1的BJ5183大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，野生型腺病毒，pIRESneo真核表達(dá)載體，pShuttle-CMV穿梭載體，含PRRSV GP5基因的pcDNA3.1-GP5重組質(zhì)粒和pcDNA3.1-ORF2重組質(zhì)粒，豬抗PRRSV和PCV-2陽性血清，均為山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T Vector，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Balb／c雌性小鼠，體重為15g／只～18g／只，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；RNA提取試劑Trizol BglⅡ，AMV反轉(zhuǎn)錄酶，dNTP，RNasin，T4DNA Ligase，SalⅠ，HindⅢ，XhoⅠ，Taq DNA聚合酶，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，購自Invitrogen公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，購自武漢博士德生物工程有限公司；PacⅠ、PmeⅠ等限制性內(nèi)切酶，購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)PCV-2ORF2、PRRSV GP5和pIRESneo載體上的IRES基因序列，使用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。引物序列為：

GP5-f：5′-GCAGATCCCACCATGGTGGAGA AA-3′（BglⅡ）；GP5-r：5′-ATGTCGACCTAAGGACGACCCC ATTG-3′（SalⅠ）。

IRES-f：5′-GAGTCGACGTCCAACTGCAGG TCGAGCAT-3′（SalⅠ）；IRES-r：5′-ATCTCGAGTCCCCGTGGTTCG GGGGGCCTA-3′（XhoⅠ）。

ORF2-f：5′-GT CTCGAG ATGACGTGTCCAAGGAGG-3′（XhoⅠ）；ORF2-r：5′-GCAAGCTTTTAAGGGTTAAGTGGGG-3′（HindⅢ）。

1.2.2 目的基因克隆和鑒定 分別將pcDNA3.1-ORF2、pIRESneo和pcDNA3.1-GP5作為模板擴(kuò)增ORF2、IRES和 GP5基因，ORF2、IRES和 GP5基因擴(kuò)增時(shí)的退火溫度分別為70℃、57℃和55℃，分別將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，然后分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑取陽性克隆，搖菌并提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測(cè)序篩選出重組質(zhì)粒pMD18-ORF2、pMD18-IRES和pMD18-GP5。

1.2.3 重組腺病毒穿梭載體pGIO的構(gòu)建 同時(shí)用SalⅠ／BglⅡ雙酶切pMD18-GP5，回收GP5基因片段，將回收產(chǎn)物克隆到pShuttle-CMV穿梭載體上，通過卡那抗性篩選陽性重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒酶切鑒定，成功構(gòu)建pG重組穿梭質(zhì)粒，將pMD18-ORF2和pMD18-IRES分別用HindⅢ／XhoⅠ和XhoⅠ／SalⅠ雙酶切，回收得到ORF2和IRES目的片段，將其克隆到pG穿梭載體上，通過卡那霉素抗性篩選陽性質(zhì)粒，再次酶切鑒定，構(gòu)建出含GP5-IRESORF2片段的重組穿梭質(zhì)粒pGIO。

1.2.4 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-GIO的構(gòu)建 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pGIO經(jīng)PmeⅠ酶切線性化后，轉(zhuǎn)化至含AdEasy-1的BJ5183大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)卡那霉素抗性瓊脂平板上篩選后，挑取小的克隆，小量制備質(zhì)粒，經(jīng)PacⅠ酶切鑒定后，得到了同源重組重組腺病毒質(zhì)粒pAd-GIO。

1.2.5 重組腺病毒制備和穩(wěn)定性鑒定 將重組腺病毒質(zhì)粒pAd-GIO轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，經(jīng)氨芐青霉素抗性瓊脂平板篩選后，挑取陽性克隆，大量制備質(zhì)粒，將質(zhì)粒用PacⅠ酶切線性化后，回收（3.5μg）；用脂質(zhì)體Lipofetamine 2000包裹回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)染生長密度大約為65%的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上293A細(xì)胞，按照試劑盒內(nèi)的說明書進(jìn)行操作，同時(shí)設(shè)pAd-GIO環(huán)狀質(zhì)粒及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染11d～15d后，細(xì)胞出現(xiàn)病變，收集細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次，離心后吸取上清液，接毒、收毒依次傳到第11代。分別提取不同代次細(xì)胞培養(yǎng)物的基因組，做PCR鑒定。

1.2.6 檢測(cè)目的蛋白表達(dá) 將制備的重組腺病毒感染293A細(xì)胞，經(jīng)過24h后，移去培養(yǎng)基，使用冷的PBS漂洗1次，用細(xì)胞刮刀收取細(xì)胞。每孔細(xì)胞加入50μL細(xì)胞裂解液后在冰上放置30min，在4℃以15 000r／min離心10min。將適量細(xì)胞裂解液樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot，方法參照文獻(xiàn)［16］。

1.2.7 測(cè)定重組腺病毒TCID50將rAd-gio用DMEM維持液依次進(jìn)行10倍梯度稀釋后，分別接種長滿293A單層細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋梯度重復(fù)接種8個(gè)孔，每個(gè)孔加入100μL。將加維持液的孔作為空白對(duì)照。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，用Reed-Muench方法算出TCID50。

1.2.8 動(dòng)物免疫試驗(yàn) 將40只6周齡～周齡雌性Balb／c小鼠隨機(jī)分為2組，每組20只。第1組小鼠采用背部皮下分點(diǎn)注射2.3×108.0TCID50重組病毒rAd-gio，2兩周后加強(qiáng)免疫。第2組小鼠采用背部皮下分點(diǎn)注射107TCID50無外源基因的空腺病毒作陰性對(duì)照。首免2周和二免2、4、6周后，分別采集血清，用本實(shí)驗(yàn)室自行優(yōu)化建立的方法檢測(cè)其中的PCV-2和PRRSV的抗體和中和抗體，操作方法參照文獻(xiàn)［17］。

2 結(jié)果

2.1 目的基因克隆及鑒定

擴(kuò)增出的ORF2、IRES和GP5基因產(chǎn)物的大小分別為603、586、702bp（圖1）。pMD18-GP5經(jīng)SalⅠ和BglⅡ雙酶切，得到2 700bp和603bp的兩條帶，pMD18-IRES經(jīng)XhoⅠ和BglⅡ雙酶切，得到2 700bp和1 189bp的兩條帶，pMD18-ORF2經(jīng)HindⅢ和BglⅡ雙酶切，得到2 700bp和1 891bp的2個(gè)條帶。

2.2 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pG經(jīng)SalⅠ和BglⅡ雙酶切，得到7 500bp和603bp的2個(gè)條帶，重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pGI經(jīng)XhoⅠ和BglⅡ雙酶切，得到7 500bp和1 189bp的兩條帶，重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pGIO經(jīng)HindⅢ和BglⅡ雙酶切，得到7 500bp和1 891bp的2個(gè)條帶（圖2）。

2.3 重組腺病毒質(zhì)粒的獲得

將重組腺病毒質(zhì)粒pAd-GIO使用PacⅠ酶切，能夠得到30 000bp和4 500bp的兩條帶（圖3），表明成功構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒。

圖1 目的基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR results of target genes

2.4 重組腺病毒的鑒定

293A細(xì)胞轉(zhuǎn)染pAd-GIO后11d～15d發(fā)生病變。細(xì)胞變圓，核固縮，最后脫落；對(duì)照組細(xì)胞生長正常，收獲的重組腺病毒命名為rAd-gio。收毒后傳代11代，每代都做PCR鑒定，結(jié)果都能擴(kuò)出目的條帶。Western blot結(jié)果表明該腺病毒能正確表達(dá)PRRSV GP5（圖4A）和PCV-2ORF2（圖4B）蛋白，將該重組腺病毒在293A細(xì)胞連續(xù)傳代到30代，pAd-GIO的滴度穩(wěn)定，平均TCID50為10-9.0／mL。

2.5 動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果

間接ELISA結(jié)果表明，首免后2周即出現(xiàn)PRRSV特異性抗體，滴度可達(dá)1∶2 000，二免后2周達(dá)到1∶3 500，4周上升到1∶6 200，一直持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束（圖5A），首免2周后即開始出現(xiàn)針對(duì)PCV-2的特異性抗體，抗體滴度為1∶350，二免2周后抗體滴度為1∶2 200，一直持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束（圖5C）。

中和抗體結(jié)果表明，PRRSV特異性中和抗體出現(xiàn)較晚，首免2周后的小鼠沒能檢測(cè)到PRRSV特異性中和抗體，二免2周后，中和抗體滴度僅為1∶3，二免后4周和6周中和抗體滴度分別為1∶8和1∶11（圖5B），而對(duì)照組卻沒能檢測(cè)到PRRSV中和抗體。首免2周后所有小鼠PCV-2特異性中和抗體滴度均較低，二免2周后免疫組的中和抗體平均滴度為1∶13，4和6周時(shí)均為1∶15（圖5D），而對(duì)照組卻沒能檢測(cè)到PCV-2中和抗體。

圖2 重組穿梭質(zhì)粒鑒定Fig.2 Identification of recombinant shuttle plasmids

圖3 重組腺病毒質(zhì)粒鑒定Fig.3 Identification of recombinant adenoviral plasmid

3 討論

隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，臨床上出現(xiàn)的疾病越來越復(fù)雜，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)多種疾病或病原混合感染的情況。其中以PCV-2和PRRSV混合感染的病例最多，在美國、西班牙、加拿大等國家有20%～60%的豬由于自然感染PCV-2和PRRSV從而引發(fā)疾病。最近幾年我國的很多地區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)豬同時(shí)感染PCV-2和PRRSV兩種病毒的病例。雖然可以通過采用科學(xué)的飼養(yǎng)管理、改善飼養(yǎng)條件、降低飼養(yǎng)密度等方法減少其發(fā)生，但是不能有效預(yù)防此疾病。應(yīng)用抗生素治療此病的效果并不明顯，豬一旦發(fā)病，很難被治愈，造成養(yǎng)豬業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管國內(nèi)外學(xué)者對(duì)該病進(jìn)行了大量研究，目前還沒有有效的防控此病的方法，更沒有商品化的疫苗。所以，研究有效預(yù)防此病的疫苗對(duì)于我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)都有非常重要意義。

圖4 Western blot分析GP5和ORF2基因在293A細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 Western blot analysis of ORF2and GP5gene expression in 293Acells

圖5 免疫小鼠PRRSV、PCV-2特異性ELISA抗體和中和抗體檢測(cè)結(jié)果Fig.5 ELISA assay for PRRSV and PCV-2specific antibodies and analysis of neutralization antibodies of sera in immunized mice

試驗(yàn)中采用的腺病毒載體系統(tǒng)是AdEasyTM系統(tǒng)［18］，骨架載體質(zhì)粒pAdEasy-1含有除El和E3基因外的腺病毒大部分DNA和人為添加的稀有酶切位點(diǎn)PacⅠ，大腸埃希菌BJ5183是一種用來做重組的細(xì)菌，菌體內(nèi)有重組酶，可以使經(jīng)PmeⅠ線性化含有目的基因的重組穿梭質(zhì)粒和pAdEasy-1質(zhì)粒發(fā)生同源重組。腺病毒包裝受到很多外部因素的影響，如轉(zhuǎn)染試劑與DNA的比例、所使用DNA的質(zhì)量、包裝細(xì)胞的生長狀態(tài)等［19］。此外，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，最好每隔30min輕輕傾斜細(xì)胞培養(yǎng)皿，使腺病毒質(zhì)粒DNA和細(xì)胞充分接觸，從而提高轉(zhuǎn)染效率。

小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠接種重組腺病毒rAd-gio后能夠產(chǎn)生針對(duì)PCV-2和PRRSV的特異性ELISA抗體和中和抗體，首免2周后和二免2、4、6周后，分別采取小鼠血清檢測(cè)PCV-2與PRRSV的ELISA抗體和中和抗體，ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果表明，首免后2周即出現(xiàn)PRRSV特異性抗體，PRRSV和PCV-2抗體滴度分別到1∶2 000和1∶350，二免后抗體滴度進(jìn)一步升高，二免后2周PRRSV和PCV-2抗體滴度分別到1∶3 500和1∶2 200，二免后4周PRRSV和PCV-2抗體滴度分別到1∶6 200和1∶2 200，并可一直持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束。中和抗體檢測(cè)結(jié)果表明，在首免后2周免疫組中和抗體滴度均較低，二免后中和抗體效價(jià)逐漸升高，二免后4周PRRSV和PCV-2中和抗體水平分別達(dá)到1∶13和1∶8，二免后6周PRRSV和PCV-2中和抗體水平分別達(dá)到1∶15和1∶11。對(duì)照組沒有檢測(cè)到PRRSV和PCV-2特異性抗體。

本試驗(yàn)將PCV-2ORF2與PRRSV GP5基因串聯(lián)重組到腺病毒表達(dá)載體中，并在293A細(xì)胞中成功包裝成腺病毒，檢測(cè)結(jié)果表明重組腺病毒能在293A細(xì)胞內(nèi)表達(dá)ORF2和GP5蛋白。試驗(yàn)中選用的腺病毒表達(dá)載體已經(jīng)進(jìn)行了缺失E1（復(fù)制相關(guān)基因）和E3（毒性基因）基因人工改造，因此應(yīng)用起來很安全。將該重組腺病毒免疫小鼠，用ELISA方法和病毒中和方法進(jìn)行檢測(cè)小鼠的體液免疫情況，結(jié)果顯示重組腺病毒能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)PCV-2和PRRSV的特異性ELISA抗體和中和抗體。將PRRSV GP5和PCV-2ORF2基因同時(shí)在同一載體中表達(dá)不僅可以一次完成免疫，避免反復(fù)免疫的麻煩，降低生產(chǎn)成本，減輕對(duì)動(dòng)物造成的的免疫抑制，從而為預(yù)防PCV-2和PRRSV混合感染莫定了重要基礎(chǔ)。

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