常 亮，魏增輝，李敏娜，梁 冬，仲偉潭

（微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司，河北 石家莊050015）

達托霉素是一種新型的環(huán)脂肽類抗菌素，具有獨特的抗菌機制。達托霉素由連接到一個環(huán)狀13－氨基酸肽的N－末端色氨酸上的癸?；鶄?cè)鏈構(gòu)成，其中肽環(huán)或羧酸肽環(huán)是由氨基酸和非蛋白質(zhì)源氨基酸通過酰胺鍵或酯鍵構(gòu)成的［1］。由于脂鏈和疏水性基團的存在，達托霉素具有一定的脂溶性，容易與細菌磷脂層反應，因而具有良好的抗菌效果。

達托霉素結(jié)構(gòu)復雜，穩(wěn)定性差，制備非常困難。國外采用微生物發(fā)酵法，通過離子交換樹脂以及疏水介質(zhì)提純達托霉素［2］，國內(nèi)中科院上海有機化學研究所采用固相合成方法首次化學合成達托霉素［3］，福建微生物研究所通過化學半合成工藝路線開發(fā)達托霉素［4］。上述工藝路線復雜、周期長、成本高、產(chǎn)量低，距離產(chǎn)業(yè)化仍有一段距離。文獻［2］報道，達托霉素在pH值較低情況下，可形成膠束狀態(tài)。作者利用這一特性，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)達托霉素，將達托霉素富集到菌絲體，對從發(fā)酵液中提取達托霉素粗品的工藝條件進行了研究。

1 實驗

1．1 試劑與儀器

達托霉素發(fā)酵液為華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司提供。

磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、珍珠巖、正丁醇均為國產(chǎn)分析純。

雙量程電子天平、FE20型實驗室pH計，梅特勒－托利多儀器上海有限公司；LC－2010AHT型高效液相色譜儀，Shimadzu；TGL－16G型高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1．2 方法

用1mol·L－1鹽酸調(diào)節(jié)達托霉素發(fā)酵液為酸性，離心分離后的澄清濾液幾乎檢測不到達托霉素，收集富含達托霉素的菌絲體；對菌絲體進行浸泡，加入正丁醇萃取轉(zhuǎn)相；收集正丁醇萃取溶液，加入丙酮，結(jié)晶、干燥，制得達托霉素粗品。

對比不同溶劑、不同pH值緩沖溶液對菌絲體的浸提效果；同時對達托霉素的結(jié)晶條件進行研究，以優(yōu)化適合工業(yè)化的提取工藝路線。

2 結(jié)果與討論

2．1 溶劑對浸提效果的影響

2．1．1 溶劑的選擇

達托霉素偏酸性，在中性pH值下分子帶負電荷，因而具有極好的水溶性。根據(jù)此特性，實驗選擇pH值7．0的緩沖溶液以及不同體積分數(shù)的乙醇、甲醇對菌絲體進行浸泡。

取達托霉素發(fā)酵液5L，調(diào)節(jié)pH值為3．0，離心分離得菌絲體。取菌絲體，均勻分為4份，以等體積的不同溶劑浸泡菌絲體30min，離心分離收集上清液，測定達托霉素濃度，計算浸提收率，結(jié)果見表1。

由表1可知，60%乙醇以及40%甲醇對菌絲體的浸提收率較高。考慮使用溶媒對環(huán)境的污染以及工業(yè)化生產(chǎn)成本問題，確定選用緩沖溶液作為溶劑。

表1 不同溶劑浸提菌絲體的效果對比Tab．1 Comparison of extraction efficiency for different solvents

2．1．2 不同pH值緩沖溶液對浸提效果的影響

取達托霉素發(fā)酵液3L，調(diào)節(jié)pH值，離心分離菌絲體，用不同pH值的等體積的緩沖溶液浸泡1h，離心分離收集上清液，測定達托霉素濃度，計算一次浸提收率；將上述離心分離所得菌絲體再浸泡1h，離心分離，測定上清液中達托霉素濃度，計算二次浸提收率。結(jié)果見表2。

表2 不同pH值緩沖溶液對菌絲體的浸提效果對比／%Tab．2 Comparison of extraction efficiency for buffer solution with different pH values／%

由表2可知，pH值6．5～7．5的緩沖溶液對達托霉素浸提效果均較好。因此，確定適宜的緩沖溶液pH值為6．5～7．5。

2．2 結(jié)晶條件的確定

在接近等電點時，達托霉素轉(zhuǎn)入正丁醇相，同時可去除部分色素及雜蛋白。按照1．2方法制備達托霉素粗品，測定不同達托霉素的結(jié)晶條件（丙酮加量、結(jié)晶方式）下所制備的達托霉素粗品的質(zhì)量和收率，結(jié)果見表3。

表3 不同結(jié)晶條件下達托霉素粗品的質(zhì)量和收率Tab．3 Quality and yield of daptomycin crude under different crystallization conditions

由表3可知，隨著丙酮加入量的增加，結(jié)晶收率相應提高，但丙酮加入量過多，會影響雜質(zhì)的去除效果，粗品純度有所下降。冷藏結(jié)晶較常溫結(jié)晶對達托霉素雜質(zhì)有更好的去除作用。因此，確定適宜的達托霉素結(jié)晶條件為以5～8BV丙酮冷藏結(jié)晶。

3 結(jié)論

確定了從發(fā)酵液中提取達托霉素的工藝條件為：調(diào)節(jié)達托霉素發(fā)酵液為酸性，對分離的菌絲體采用pH值6．5～7．5的緩沖溶液浸提，加入正丁醇進行萃取使達托霉素轉(zhuǎn)相，收集正丁醇萃取溶液加入5～8 BV丙酮進行冷藏結(jié)晶，干燥后制得達托霉素粗品。該工藝路線簡單、經(jīng)濟，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

［1］史麗娟，石磊．新型抗革蘭陽性菌藥物——達托霉素［J］．中國醫(yī)藥導刊，2008，10（7）：1100－1101．

［2］T·J·凱萊赫，賴正吉，J·P·德庫西，等．高純度脂肽、脂肽膠束及其制備方法［P］．CN 1 404 487A，2003－03－19．

［3］徐紅巖，陸婷婷．一種達托霉素的合成方法［P］．CN 101 235 080A，2008－08－06．

［4］鄭衛(wèi)，程元榮，周劍，等．一種流加癸酸鹽發(fā)酵達托霉素的方法［P］．CN 101 880 703A，2010－11－10．