王文軍 李盛村 鮑捷 王靜 王國祥

蘇州大學(xué)體育學(xué)院（江蘇蘇州 215021）

末端?。‥nthesiopathy）是指肌腱、韌帶、關(guān)節(jié)囊纖維層等與骨的附著部分發(fā)生勞損或退行性病變，運(yùn)動(dòng)員末端病常見網(wǎng)球肘、跟腱止點(diǎn)炎和跳躍膝等。大量研究證實(shí)，局部過度應(yīng)力刺激是末端病發(fā)生的主要原因，其病理改變涉及到末端區(qū)的肌腱、纖維軟骨區(qū)、鈣化軟骨區(qū)、骨及腱圍等多種組織［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，末端病動(dòng)物模型的末端區(qū)存在大量功能細(xì)胞死亡以及組織退化變性，而在相應(yīng)的部位存在表達(dá)增多的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 （inducible nitric oxide synthase，iNOS）。iNOS可以誘導(dǎo)產(chǎn)生持久而大量的一氧化氮 （nitric oxide，NO），可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，破壞細(xì)胞外基質(zhì)等一系列分解代謝。本文就應(yīng)力刺激下iNOS/NO信號(hào)通路在末端病發(fā)生發(fā)展過程中作用機(jī)制作一綜述。

1 iNOS/NO信號(hào)通路分子機(jī)制

NO最早被認(rèn)為是血管內(nèi)皮舒張因子，具有舒張血管作用，而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)NO能夠在不同組織中發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)［2］。NO由一氧化氮合酶 （nitric oxide synthase，NOS）誘導(dǎo)合成，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在三種不同形式的NOS，即神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）、iNOS、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS），其中nNOS和eNOS分別表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，兩者以Ca2+依賴方式合成較低含量的NO，參與機(jī)體生理過程［3］；與前兩者不同，iNOS是強(qiáng)效的、非鈣依賴式合酶，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量而持久的NO［4］。在炎癥環(huán)境中可由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生iNOS，在軟骨細(xì)胞內(nèi)iNOS隨著白介素-1（IL-1）和白介素-18（IL-18）上調(diào)而升高［5］，另外細(xì)胞接受大負(fù)荷機(jī)械應(yīng)力刺激，也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生iNOS［6］。因此，在末端病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模過程中，首先由于過度機(jī)械負(fù)荷刺激而導(dǎo)致末端區(qū)組織環(huán)境惡化而產(chǎn)生炎性環(huán)境。隨后應(yīng)力刺激和炎癥環(huán)境共存，激活iNOS/NO信號(hào)通路參與組織分解代謝，造成組織自我修復(fù)不足以代償破壞過程，從而末端區(qū)病變得以發(fā)生和發(fā)展。

iNOS/NO信號(hào)通路介導(dǎo)的末端區(qū)病變，實(shí)際上是應(yīng)力應(yīng)激共刺激引發(fā)的一系列的不良循環(huán)過程，最終效應(yīng)是對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生毒性作用。iNOS/NO信號(hào)通路在細(xì)胞中的調(diào)節(jié)變化過程如下［7］：（1）細(xì)胞外基質(zhì)因炎性介質(zhì)或者機(jī)械應(yīng)力影響而刺激細(xì)胞產(chǎn)生信號(hào)應(yīng)答，信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)并激活轉(zhuǎn)錄因子蛋白（NF-κB）；（2）NF-κB刺激細(xì)胞合成iNOS和環(huán)氧化酶-2（cyclo-oxygenase-2，COX-2），iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生大量NO，COX-2催化合成前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）；（3）PGE2募集更多的炎癥細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)，NO和超氧化物（superoxide ，O2-）結(jié)合導(dǎo)致過氧硝酸鹽ONOO-形成；（4）ONOO-使得細(xì)胞外基質(zhì)中膠原氧化硝酸化，繼而刺激絲裂原蛋白活性激酶（p38 MAPK）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）磷酸化；（5）p38MAPK進(jìn)一步激活促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導(dǎo)合成iNOS和COX-2蛋白， 導(dǎo)致NO和PGE2形成［8］。抑制p38 MAPK，ERK1/2或者NF-κB以阻礙iNOS和COX-2蛋白合成，導(dǎo)致NO和PGE2減少，繼而發(fā)揮抗炎保護(hù)效應(yīng)［9］。 NO和ONOO-合成可以使用iNOS抑制劑阻斷，而PGE2可以用COX-2抑制劑阻斷［10］。因此，在iNOS/NO信號(hào)通路中應(yīng)用合理的抑制劑可以阻斷信號(hào)通路傳播，中斷或者減弱不良循環(huán)過程。

2 iNOS/NO信號(hào)通路和末端病相關(guān)性研究

末端病開始被稱為“附著區(qū)炎”，它是由La Cava 1952年在描述頸椎韌帶附著點(diǎn)的變性疾患時(shí)作為一個(gè)獨(dú)立疾病首先提出的，并于1959年正式用 “末端病”的名稱［11］，末端病主要用于概括因過度使用而導(dǎo)致腱以及腱周圍疼痛和炎癥等病理改變的疾患［12］。如今，末端病的名稱已被人們所接受，研究者采用各種方法對(duì)末端區(qū)正常解剖結(jié)構(gòu)及末端病的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行研究，對(duì)末端病的認(rèn)識(shí)正逐步深化［13］。

NO最早的生物學(xué)效應(yīng)被認(rèn)為是促進(jìn)血管舒張，因此eNOS誘導(dǎo)的NO在末端病中的作用也較早地被研究。扈盛等［14］采用電刺激跳躍法制造末端病模型，觀察末端病大鼠跟腱末端區(qū)eNOS的分布規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組主要在腱圍處有eNOS大量表達(dá)；造模組大鼠跟腱、纖維軟骨、鈣化軟骨、跟骨、骨髓腔、腱骨關(guān)節(jié)面及腱圍等部位eNOS表達(dá)明顯，其中腱圍及骨髓腔處表達(dá)最多。與其結(jié)果一致，黎明等［15］的研究發(fā)現(xiàn)末端病大鼠在跟腱、纖維軟骨、跟骨、骨髓腔、腱骨關(guān)節(jié)面及腱圍均可見大量eNOS表達(dá)。末端區(qū)各部位無論是在代償適應(yīng)期還是在損傷康復(fù)期，eNOS的表達(dá)總是會(huì)比正常生理狀態(tài)時(shí)表達(dá)有所增加。eNOS在末端病大鼠模型中各部位普遍表達(dá)升高，誘導(dǎo)產(chǎn)生少量NO，參與在機(jī)體為適應(yīng)機(jī)械負(fù)荷時(shí)出現(xiàn)的代償反應(yīng)，主要與血管增生有關(guān)［16］。

黎明等［15］在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)末端病組跟腱、纖維軟骨、鈣化軟骨、跟骨區(qū)及腱骨關(guān)節(jié)面iNOS表達(dá)顯著增多。與eNOS相比，iNOS可以誘導(dǎo)大量NO，可能介導(dǎo)組織損傷過程，與末端病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系更為密切。末端區(qū)組織修復(fù)和損傷是一個(gè)連續(xù)進(jìn)行的動(dòng)態(tài)過程，由于機(jī)械負(fù)荷、炎癥反應(yīng)等因素導(dǎo)致的組織破壞超過機(jī)體修復(fù)能力而發(fā)生末端?。?7］。iNOS/NO信號(hào)通路是感受應(yīng)力刺激和炎癥應(yīng)答的信號(hào)系統(tǒng)，研究者主要從末端病模型中發(fā)現(xiàn)iNOS在末端區(qū)大量表達(dá)，可能參與末端病發(fā)病過程。史清釗等［18］采用電擊跳躍法建立大鼠跟腱末端病模型，該模型在HE染色中觀察到典型的末端病病征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，跟腱末端病大鼠末端區(qū)包括跟腱、纖維軟骨區(qū)、鈣化軟骨區(qū)和腱骨關(guān)節(jié)面等組織均出現(xiàn)iNOS和白介素-6（IL-6）陽性細(xì)胞，并且在經(jīng)過4天安靜飼養(yǎng)后，IL-6、iNOS含量仍高于安靜對(duì)照組，提示iNOS和末端病發(fā)病機(jī)制有重要聯(lián)系，并且iNOS能夠持久而穩(wěn)定地作用于末端病大鼠自然恢復(fù)期。此外，王和平等［19］更加直接而有針對(duì)性地研究了iNOS在末端病大鼠跟腱末端區(qū)的表達(dá)和分布。其研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，末端病模型組大鼠跟腱、纖維軟骨及鈣化軟骨區(qū)的iNOS表達(dá)具有非常顯著差異，腱骨關(guān)節(jié)面、跟骨區(qū)差異有顯著性差異，空白對(duì)照組均無iNOS陽性表達(dá)，據(jù)此可排除內(nèi)源性過氧化物酶干擾。Szomor等［20］對(duì)機(jī)械應(yīng)力刺激導(dǎo)致的肌腱損傷模型進(jìn)行研究，并且檢測(cè)了iNOS、eNOS和nNOS三種一氧化氮合酶亞型的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過過度應(yīng)力刺激后，大鼠肌腱末端區(qū)組織三種亞型的NOS都有所增加，以iNOS的增加幅度最為明顯。

上述結(jié)果表明，NO水平和機(jī)械刺激負(fù)荷保持一致，在生理水平機(jī)體產(chǎn)生少量NO是肌腱和纖維軟骨區(qū)等組織重塑過程所必需的，而當(dāng)適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刺激產(chǎn)生較高水平的NO時(shí)，末端區(qū)各組織產(chǎn)生適應(yīng)，通過促進(jìn)血管再生，增加血流量和基質(zhì)合成以及細(xì)胞增殖，加速肌腱、纖維軟骨區(qū)的功能適應(yīng)和恢復(fù)。Madhavan等［21］研究報(bào)道，利用循環(huán)拉伸刺激（cyclic tensile strain，CTS）裝置對(duì)從關(guān)節(jié)軟骨組織中獲取的軟骨細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)拉伸，抑制了由IL-1β誘導(dǎo)的促炎基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，機(jī)械刺激結(jié)束后影響仍會(huì)持續(xù)，其持續(xù)效益與拉伸刺激的時(shí)間密切相關(guān)。然而，長期過度負(fù)荷導(dǎo)致末端區(qū)產(chǎn)生大量iNOS，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO在末端區(qū)局部聚集，形成一個(gè)以p38 MAPK、NF-κB、COX-2和PGE2等多種因子參與的組織分解代謝惡性循環(huán)，最終破壞末端區(qū)肌腱、纖維軟骨、腱骨關(guān)節(jié)面等組織。

3 iNOS/NO信號(hào)通路與末端病細(xì)胞凋亡

末端病中組織中過度激活的iNOS/NO信號(hào)通路，對(duì)末端區(qū)各組織內(nèi)的功能細(xì)胞有毒害作用。末端區(qū)主要組織中存在肌腱細(xì)胞、纖維軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等，大量NO的產(chǎn)生與這些功能細(xì)胞的凋亡或死亡有關(guān)。細(xì)胞凋亡是組織退化變性的基礎(chǔ)，也是末端病病理改變的條件之一。NO通過多種途徑促進(jìn)末端區(qū)中肌腱細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和纖維軟骨細(xì)胞凋亡。胡亞哲等［22］研究結(jié)果表明，末端病發(fā)生時(shí)，末端區(qū)跟腱、纖維軟骨區(qū)、腱圍組織、腱骨關(guān)節(jié)面軟骨、跟骨和骨髓等部分的細(xì)胞凋亡明顯增多，其中以跟腱、纖維軟骨區(qū)、腱圍組織、關(guān)節(jié)軟骨面、骨髓腔等處的細(xì)胞凋亡指數(shù)增加最為明顯。這些細(xì)胞凋亡指數(shù)異常增高的區(qū)域與其他研究者報(bào)道的末端病大鼠末端區(qū)iNOS異常升高的部位基本一致［19］，由此推測(cè)iNOS/NO信號(hào)通路參與了末端病發(fā)病中末端區(qū)的細(xì)胞凋亡調(diào)控過程。

iNOS在末端病發(fā)生過程中過量表達(dá)，與功能細(xì)胞凋亡發(fā)生較多的部位高度一致。大量研究已經(jīng)證實(shí)iNOS/NO信號(hào)通路激活可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，并且細(xì)胞凋亡的發(fā)生和激活p38MAPK介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)［23］。 Wu等［24］將一組人類軟骨細(xì)胞和NO外源性供體SNP（sodium nitroprusside）共同培養(yǎng)，另一組將軟骨細(xì)胞和脂多糖（lipopolysccharide，LPS）、干擾素（IFN-γ）共同培養(yǎng)，產(chǎn)生內(nèi)源性NO，研究結(jié)果顯示兩種方式均引起活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和細(xì)胞色素C水平上升，同時(shí)細(xì)胞凋亡標(biāo)志物天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）增加。相似的細(xì)胞培養(yǎng)液中，使用NOS抑制劑L-NMA進(jìn)行干預(yù)后，NO水平降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡標(biāo)志物也伴隨減少［25］。iNOS誘導(dǎo)出的NO通過引起凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)而參與細(xì)胞凋亡。

進(jìn)一步的研究更確切地解釋了iNOS/NO信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。Wang等［26］采用新的NO供體NOC-18來產(chǎn)生NO，采用流式細(xì)胞術(shù)和末端標(biāo)記法來檢測(cè)NO誘導(dǎo)的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示p38MAPK、NF-ΚB、caspase-3等蛋白表達(dá)增加，并且NO供體NOC-18引起的細(xì)胞凋亡具有濃度依賴性，而這種細(xì)胞凋亡可以被p38MAPK特異性抑制劑SB203580減弱。該研究表明，末端病中軟骨細(xì)胞凋亡與NO濃度存在依賴性，而這種NO促進(jìn)凋亡的機(jī)制與p38MAPK信號(hào)激活密切相關(guān)。p38MAPK通過激活軟骨細(xì)胞內(nèi)NF-κB和caspase-3活性產(chǎn)生細(xì)胞凋亡作用［27］。 Cheng等［28］通過抗氧化劑SeMet預(yù)處理軟骨細(xì)胞，顯著抑制了軟骨細(xì)胞中由IL-1β誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO和PGE2，并且也減弱了p38MAPK活性?？寡趸瘎p少NO濃度和p38MAPK活性的效應(yīng)可能是通過終止ONOO-產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)，繼而阻止了iNOS/NO信號(hào)通路傳播形成的惡性循環(huán)。此外，有研究證實(shí)在半月板中纖維軟骨細(xì)胞的凋亡也是通過p38MAPK途徑介導(dǎo)的，細(xì)胞凋亡與iNOS表達(dá)增多有關(guān)［29，30］，這可能也是末端區(qū)纖維軟骨細(xì)胞凋亡途徑。雖然末端病中肌腱細(xì)胞的凋亡與iNOS/NO信號(hào)通路密切相關(guān)，但并沒有研究明確指出其過程也是p38MAPK介導(dǎo)的，其機(jī)制有待于今后繼續(xù)研究。

NO誘導(dǎo)除了可以通過p38MAPK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑對(duì)末端病各部位產(chǎn)生影響之外，也有研究表明NO可以通過參與對(duì)細(xì)胞線粒體功能的損害而發(fā)揮其毒性作用。Whiteman等［31］通過使用人類關(guān)節(jié)軟骨來研究過氧硝酸鹽（Peroxynitrite）導(dǎo)致的細(xì)胞死亡機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)增加過氧硝酸鹽可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加和線粒體功能障礙，但是在這個(gè)過程中沒有發(fā)現(xiàn)凋亡標(biāo)志物caspase-3激活。這表明，NO導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙是一條非caspase依賴的細(xì)胞凋亡新途徑。

以上研究表明，iNOS誘導(dǎo)大量NO，激活p38MAPK信號(hào)通路，引起下游凋亡調(diào)控蛋白caspase-3的增加而執(zhí)行細(xì)胞凋亡。凋亡過程中可能同時(shí)伴有細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙，而引起非caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑。由此可見iNOS/NO信號(hào)通路和末端病發(fā)生中的細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)，但是其確切分子機(jī)制需要更多深入的研究。

4 iNOS/NO信號(hào)通路與末端病組織中細(xì)胞外基質(zhì)

末端區(qū)各組織中除了細(xì)胞外，還有大量的細(xì)胞外基質(zhì)，而細(xì)胞外基質(zhì)中的營養(yǎng)成分、結(jié)構(gòu)比例的變化是末端病發(fā)生的重要因素。iNOS/NO信號(hào)通路引起細(xì)胞凋亡的作用部分地通過細(xì)胞外基質(zhì)的變化而影響，細(xì)胞凋亡又反過來影響細(xì)胞外基質(zhì)的變化。大量NO對(duì)肌腱細(xì)胞、纖維軟骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的外基質(zhì)有重要影響。iNOS/NO信號(hào)通路激活而對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的最大影響就是上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）。MMPs是一系列破壞細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子TNF-α和IL-1等均可以通過激活p38MAPK來誘導(dǎo)MMP-13的表達(dá)［32］，進(jìn)而參與末端區(qū)中的細(xì)胞外基質(zhì)破壞。有體外研究使用大鼠巨噬細(xì)胞與NO及活性氮顆粒（reactive nitrogen species，RNS）共培養(yǎng)，也可以調(diào)節(jié)MMP-9活性［33］。 另外，有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)細(xì)胞采用抗氧化劑預(yù)處理，能阻止NO和O2-合成ONOO-的過程，抑制MMPs類蛋白活性［34］。Molloy等［35］對(duì)取材于損傷肩袖的肌腱細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)iNOS對(duì)肌腱細(xì)胞外基質(zhì)的影響類似于軟骨細(xì)胞，使用NO刺激干預(yù)后MMP-10表達(dá)升高，刺激膠原（I、III、IV）和蛋白聚糖的更新，增加肌腱的重建速率。這些研究都表明了NO及其氧化衍生物（例如ONOO-）參與上調(diào)末端區(qū)中肌腱細(xì)胞和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的MMPs活性，是引發(fā)末端區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)降解退化的因素之一。

iNOS/NO信號(hào)通路也可以通過促進(jìn)PGE2等炎性介質(zhì)而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的膠原和多糖合成。Otsuka等［36］在骨關(guān)節(jié)炎感染的軟骨中發(fā)現(xiàn)，軟骨組織中的PGE2像NO一樣升高。PGE2是COX-2的激活產(chǎn)物，根據(jù)其濃度不同可以在軟骨中發(fā)揮分解和合成效應(yīng)，而高濃度的PGE2可以聯(lián)合IL-1β降解人和牛軟骨基質(zhì)的蛋白聚糖［37］。 Bhat等［38］在研究中采用iNOS選擇性抑制劑S-methylisothiourea和兩種COX-2的抑制劑（rofecoxib，mefenamic acid）來觀察其對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種抑制劑均可改善關(guān)節(jié)炎軟骨中細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，并且聯(lián)合使用三種藥物對(duì)關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)改善效果最為明顯。

就iNOS/NO信號(hào)通路傳遞途徑而言，NO增多引起NF-κB的激活，從而使COX-2活性增加，繼而催化PGE2的產(chǎn)生［39］，PGE2募集炎癥細(xì)胞聚集在末端區(qū)產(chǎn)生炎癥環(huán)境，因而組織局部IL-1、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子增多［40］，引起以iNOS/NO為中心的惡性循環(huán)過程持續(xù)發(fā)展，最終促進(jìn)末端病的發(fā)生發(fā)展。目前對(duì)iNOS/NO和末端病中軟骨細(xì)胞的外基質(zhì)降解相關(guān)研究較多，關(guān)于肌腱細(xì)胞外基質(zhì)受NO影響的研究較少。

5 展望

應(yīng)力刺激和炎癥反應(yīng)激活iNOS/NO信號(hào)通路與末端病的發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系。研究證實(shí)iNOS能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生大量NO參與末端區(qū)分解代謝，引起細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解。目前研究多集中于軟骨細(xì)胞和iNOS/NO的關(guān)系，而且iNOS/NO引起的一系列細(xì)胞內(nèi)分子發(fā)生機(jī)制還不夠清楚，特別是肌腱中iNOS/NO信號(hào)通路的作用機(jī)制有待今后繼續(xù)深入研究。抑制iNOS/NO信號(hào)通路中的一些組分，可能有助于抑制末端病的發(fā)展。

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