王培園，李 結(jié)，朱興全，袁子國*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，甘肅蘭州 730046；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

弓形蟲病是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種呈世界性分布且嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病。弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲，能夠感染包括幾乎所有哺乳動物和一些鳥類。據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界約有三分之一成年人感染弓形蟲。絕大多數(shù)弓形蟲感染呈隱性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀，但對于器官移植、惡性腫瘤及艾滋病等免疫抑制及免疫功能缺陷者，弓形蟲是重要的致命因子之一。孕婦感染弓形蟲、不僅容易導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和胎兒畸形，而且可以通過垂直傳播，導(dǎo)致胎兒或嬰兒發(fā)育畸形、智力障礙、腦膜炎甚至死亡等臨床癥狀，弓形蟲感染被認為是導(dǎo)致畸宮內(nèi)感染綜合癥的首要病因[1]。

由于弓形蟲的生活史和致病機理比較復(fù)雜，到目前為止，尚無治療弓形蟲病的理想藥物，因此，使用安全有效的疫苗接種被認為可能是預(yù)防弓形蟲病的最佳預(yù)防措施[2]。近年來，弓形蟲基因工程疫苗研究已成為熱點。目前在弓形蟲疫苗候選抗原分子的鑒定、基因克隆及表達等方面開展了廣泛研究，其疫苗的研究取得了迅速進展。本文就近年來弓形蟲基因工程疫苗的研究現(xiàn)狀及進展作一綜述。

1 亞單位疫苗

亞單位疫苗是從病原中分離的一個或幾個具有免疫原性的抗原決定族表位制成的蛋白質(zhì)疫苗[3]，近年來常用于研究弓形蟲亞單位疫苗的候選抗原主要有：表面抗原SAG1（P30）、棒狀體蛋白 ROP1、ROP2，致密顆粒蛋白GRA1及微線體蛋白M IC3等。

Liu等采用重組狂犬病病毒表達的Tg SAG1蛋白免疫BALB/c小鼠，小鼠對弓形蟲RH株和狂犬病病毒均產(chǎn)生了較好的免疫性[4]。Ismael等研究顯示M IC3是一種黏附性蛋白，能夠成為一種重要的抗弓形蟲病的候選疫苗因子[5]。盡管亞單位疫苗安全性要比傳統(tǒng)滅活和減毒疫苗免疫效果好，但免疫原性較弱，不能被抗原遞細胞系統(tǒng)（APCS）有效識別、呈遞。

2 核酸疫苗

核酸疫苗是將編碼病原生物的某種抗原基因的重組質(zhì)粒直接接種機體，核酸進入機體細胞內(nèi)，表達編碼的抗原，激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抵抗病原侵入或致病的免疫力。相比傳統(tǒng)疫苗，核酸疫苗可誘發(fā)機體全面免疫應(yīng)答、能夠聯(lián)合免疫，制備多價疫苗且制備簡單，成本低廉，便于儲存和運輸。核酸疫苗的候選目的基因主要為編碼表面抗原（SAG）、棒狀體蛋白（ROP）、微線體蛋白（M IC）及致敏顆粒蛋白（GRA）等。

2.1 表面抗原（SAG）核酸疫苗 表面抗原即弓形蟲速殖子表面膜蛋白。弓形蟲表面抗原家族龐大，主要包括SAG1、SAG2、SAG3、SAG4等。在弓形蟲不同的生活階段，其表面抗原也不完全相同。弓形蟲的表面抗原雖然復(fù)雜多樣，但其蛋白序列的總體結(jié)構(gòu)大致相似[6]。

Ma等對弓形蟲速殖子可溶性抗原進行分析，表明了包括SAG1在內(nèi)的11個蛋白具有抗原性和免疫原性，并認為這些蛋白可以作為抗弓形蟲疫苗的候選抗原[7]。Shang等用pVAX/TgSAG1首免，重組病毒rPRV/TgSAG1加強免疫，結(jié)果顯示：免疫組小鼠存活時間明顯延長（15.44±5.0 d），存活率達40%，而對照組小鼠在11 d內(nèi)全部死亡[8]。而通過酵母菌分泌表達載體pPICZaαA表達的SAG2基因表達的22 ku蛋白產(chǎn)物，經(jīng)腹腔免疫BALB/c小鼠后能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗SAG2抗體[9]，表明SAG2具有一定的免疫原性。

2.2 棒狀體蛋白（ROPs）核酸疫苗 弓形蟲棒狀體蛋白是由棒狀體所分泌的對弓形蟲侵入宿主細胞起重要作用的蛋白質(zhì)。目前研究較多的棒狀體蛋白是ROP1和ROP2。ROP1基因是一個單拷貝基因，ROP2則是一個非常大的蛋白家族，主要包括 ROP2、ROP3、ROP4、ROP5、ROP7、ROP8、ROP16和ROP18等。

Dziadek等用大腸桿菌表達的重組ROP2和ROP4免疫C3H/He J小鼠，表明兩種重組抗原均能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)性Thl和Th2型免疫反應(yīng)，兩者對弱毒DX株弓形蟲的攻擊感染均能夠提供部分保護，免疫組腦組織中包囊數(shù)量可減少46%[10]。Yuan等用構(gòu)建的pVAX-ROP16真核表達質(zhì)粒接種小鼠后，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞免疫與體液免疫應(yīng)答，RH株攻蟲感染結(jié)果顯示：免疫組小鼠存活時間明顯延長（21.6±9.9 d），表明ROP16具有較好的免疫原性，可以作為弓形蟲疫苗的候選分子[11]。同時pVAX-ROP18真核表達重組質(zhì)粒接種小鼠后，同樣也能夠誘導(dǎo)強烈的T細胞免疫反應(yīng)，而且免疫組小鼠存活時間明顯延長（27.9±15.1 d）[12]。

2.3 微線體蛋白（MIC）核酸疫苗 微線體是位于弓形蟲前部的分泌器官，所有微線體蛋白都是在粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，再經(jīng)高爾基體加工后到達微線體，最后分泌到蟲體外。目前已知的微線體蛋白有15種以上，包括M IC1-M IC12、AMA1、Tg-SUB1、TgSUB2等。

Fang等將M IC3基因克隆至“自殺式”載體（Suicidal vector）pSCA1，并比較pSCA/M IC3和傳統(tǒng)真核表達載體疫苗pcDNA/M IC3的免疫保護性，兩者分別免疫BALB/c小鼠后兩組小鼠的抗M IC3蛋白特異性抗體滴度、淋巴細胞體外增殖反應(yīng)的刺激指數(shù)和IFN-γ的表達水平均比對照組明顯增高（p<0.05），而且免疫組小鼠的存活時間均比對照組顯著延長[13]。以pVAX-M IC6真核重組表達質(zhì)粒接種小鼠后，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞免疫與體液免疫應(yīng)答，淋巴細胞體外增值反應(yīng)的刺激指數(shù)和IFN-γ、IL2、IL4及IL10的表達水平均比對照組明顯增高（p<0.05），結(jié)果顯示免疫組小鼠存活時間明顯延長（13.3±1.2 d），表明M IC6具有較強的免疫原性[14]。此外，采用pcDNA-M IC8免疫昆明鼠，結(jié)果顯示可誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞免疫與體液免疫應(yīng)答，免疫鼠經(jīng)腹腔注射RH株弓形蟲速殖子，免疫組小鼠的平均存活時間較對照組顯著延長（10.3±0.9 d）[15]，表明M IC8也屬于良好的弓形蟲疫苗候選抗原。

2.4 致密顆粒蛋白（GRA）核酸疫苗 致密顆粒蛋白是弓形蟲侵入宿主細胞后納蟲泡后不久，由弓形蟲的另一類細胞器一致密顆粒釋放的內(nèi)容物。目前已報道的致密顆粒蛋白約有13種，包括GRA1～GRA9、三磷酸核苷水解酶的同工酶NTPaseI和NTPaseⅡ、蛋白酶的抑制劑等。

Golkar等利用重組GRA2蛋白和佐劑單磷酰脂質(zhì)A（MPL）免疫CBA/J小鼠后，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高比例的IgG2a/IgG1特異性抗體，脾細胞體外經(jīng)分泌——排泄抗原刺激后產(chǎn)生大量的IFN-γ和IL-2。經(jīng)腹腔接種弓形蟲包囊后，免疫組小鼠腦中包囊數(shù)明顯少于對照組[16]。證明重組GRA2能夠有效抵抗弓形蟲慢性感染。陳媛媛等通過原核細胞表達的GRA3能夠被弓形蟲陽性血清識別，具有較好的免疫反應(yīng)活性[17]。Chen等利用脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒pcDNA/GRA4，肌肉注射免疫C57BL/6小鼠后。經(jīng)口感染80個ME49株包囊，結(jié)果顯示脂質(zhì)體組小鼠的生存率達到72.7%，單獨接種重組質(zhì)粒組的生存率為54.5%，而空質(zhì)粒對照組小鼠全部死亡[18]。表明GRA4具有良好的抗弓形蟲感染的活性。

2.5 復(fù)合基因疫苗 復(fù)合疫苗是利用多個不同抗原的蛋白疫苗或編碼基因構(gòu)成的核酸疫苗的組合，制成不同形態(tài)的多種抗原成分為基礎(chǔ)的多肽或多基因疫苗，該疫苗能夠有效彌補單價疫苗的不足，增強免疫效果，提高保護率。

Wang等采用SAG1和M IC4制成的多抗原DNA疫苗，能夠顯著激發(fā)BALB/c小鼠體液免疫和細胞免疫，提高小鼠的存活率[19]。Xue等構(gòu)建了 pcDNA3.1-SAG1-ROP2-GRA2多抗原疫苗，并用IL-12作為佐劑增強其免疫效果，經(jīng)肌肉免疫BALB/c小鼠后觀察其免疫效果[20]。結(jié)果顯示該重組質(zhì)粒比單獨表達SAG1、ROP2、GRA2的重組質(zhì)粒免疫產(chǎn)生的體液免疫和Th1型細胞免疫反應(yīng)更強烈，并且以IL-12為佐劑可以提高免疫效果，顯著延長小鼠的存活時間。Cui等構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSAG1-ROP2-SAG2，并以p IL-12作為佐劑做比較，分別免疫BALB/c小鼠發(fā)現(xiàn)，有p IL-12的誘導(dǎo)的體液免疫和Th1型免疫明顯強于沒有 p IL-12組[21]。Yan等利用構(gòu)建的pVAX/PLP1（穿孔素樣蛋白）真核表達質(zhì)粒免疫小鼠，再用弓形蟲RH株速殖子感染小鼠。結(jié)果顯示pVAX/PLP1免疫組和pVAX/PLP1+pVAX/IL-18聯(lián)合免疫組小鼠可有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫反應(yīng)，小鼠平均存活時間顯著延長[22]。并且pVAX/PLP1+pVAX/IL-18聯(lián)合免疫組免疫效果明顯優(yōu)于pVAX/PLP1組，表明pVAX/IL-18是一個較好的分子免疫佐劑，能夠有效增強免疫效果。

3 多表位疫苗

多表位疫苗是利用基因重組技術(shù)將不同抗原分子設(shè)計成聯(lián)合抗原或?qū)⒕幋a不同抗原分子的功能性表位氨基酸的基因片段串連，在宿主細胞內(nèi)利用真核啟動子來持續(xù)高效表達多個多肽類免疫原，從而給宿主免疫系統(tǒng)以持續(xù)的、多層次的刺激，可以顯著提高免疫效率，這類疫苗針對性強、安全性高，是一個新的發(fā)展趨勢。

史霖等構(gòu)建成含SGA1、GRA1、GRA4和GRA2多個T、B細胞表位的弓形蟲DNA疫苗。以該多表位DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，然后進行RH株弓形蟲攻擊感染保護實驗，結(jié)果顯示該疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的體液及細胞免疫應(yīng)答，免疫小鼠存活期顯著延長[23]。譚逵等采用生物信息學(xué)方法對弓形蟲新基因WX2進行表位分析預(yù)測，利用編碼2個表位的片段W 2a和W2b構(gòu)建新基因雙表位疫苗pcDNA3-W 2a2b免疫小鼠，弓形蟲攻擊感染試驗結(jié)果顯示，雙表位疫苗組小鼠血清IgG抗體水平顯著高于對照組和單表位疫苗，而且小鼠存活時間顯著延長[24]。Cong等將已知的弓形蟲主要抗原SAG1、GRA1、ROP2和GRA4的表位串聯(lián)起來構(gòu)建了多表位疫苗，以霍亂毒素的亞基A2/B（CTXA2/B）作佐劑，RH強毒株攻毒免疫BALB/c小鼠，結(jié)果顯示誘導(dǎo)產(chǎn)生了顯著的體液和細胞免疫，并且以CTXA2/B作為分子佐劑可提高免疫應(yīng)答強度和小鼠存活率[25]。

4 病毒活載體疫苗

近年來，重組病毒載體介導(dǎo)外源基因表達提供更為安全可靠的載體渠道，以病毒載體為基礎(chǔ)構(gòu)建的重組活載體疫苗成為弓形蟲基因工程疫苗研究領(lǐng)域的熱點。

A lexandre等構(gòu)建含弓形蟲SAG2基因的重組腺病毒Ad-SAG2免疫小鼠，能夠有效誘導(dǎo)SAG2細胞內(nèi)表達，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，經(jīng)弓形蟲P-Br株包囊感染后，免疫鼠組織中包囊數(shù)量減少85%[26]。Erica等通過構(gòu)建含弓形蟲SAG1基因的rAd腺病毒rAd-SAG1免疫小鼠，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞免疫與體液免疫應(yīng)答，其IFN-γ和IL12的表達水平均比對照組明顯增高（p<0.05），攻蟲試驗表明，免疫鼠能有效抵抗弓形蟲感染[27]。此外，Nie等分別構(gòu)建重組偽狂犬病毒rPRV-SAG1和rPRV-M IC3免疫BALB/c小鼠，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生強烈的細胞免疫與體液免疫應(yīng)答，其IFN-γ和IL2的表達水平均較對照組明顯增高（p<0.05），rPRV-SAG1和rPRV-M IC3免疫組在攻蟲后的存活率分別為 33.3%和 50%[28]。

5 存在的問題及展望

目前弓形蟲基因工程疫苗的研究顯示，盡管它們能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生一定的保護作用，但仍然存在一些問題，比如大多數(shù)單個抗原疫苗誘導(dǎo)的免疫保護效果十分有限，免疫效果不夠理想，同時也存在生產(chǎn)過程復(fù)雜，技術(shù)難度大及成本高等缺點，尤其是對RH強毒株的致死性攻擊感染還不能獲得完全保護。這可能與核酸疫苗的免疫原性、轉(zhuǎn)化效率以及能否持續(xù)表達有關(guān)。因此，在今后弓形蟲疫苗的研究中，還應(yīng)著重于對弓形蟲保護性抗原的進一步深入研究，繼續(xù)篩選相對保守、抗原性更強的疫苗候選分子，從而避免株間的免疫保護差異。選擇合適的分子佐劑也十分重要，需要更加深入的研究。此外，免疫方式、接種以及評估體系的建立也有待于作進一步探索。隨著生物信息學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，對弓形蟲保護性抗原和免疫機制研究的不斷深入，弓形蟲疫苗的研制勢必將會取得重大突破，并在控制人和動物弓形蟲病方面發(fā)揮重要作用。

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