鄭 芬，芮勇宇（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，廣州 510515）

隨著抗生素的大量使用，臨床耐碳青霉烯銅綠假單胞菌日漸增多，給臨床抗感染治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［1］。銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，本研究主要探討碳青霉烯酶、可移動(dòng)耐藥元件整合子Ⅰ和插入序列共同區(qū)（ISCR1）與耐藥性的關(guān)系，并采用腸桿菌科間重復(fù)一致性序列（ERIC）－聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)臨床分離的59株耐碳青霉烯銅綠假單胞菌進(jìn)行同源性和傳播機(jī)制研究，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源及鑒定 收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院2011年1～12月臨床分離的碳青霉烯耐藥的銅綠假單胞菌（排除重復(fù)菌株）共59株，其中25株來(lái)自于呼吸科、18株來(lái)自于外科重癥監(jiān)護(hù)病房、16株來(lái)自于神經(jīng)內(nèi)科，這些菌株均分離于下呼吸道感染患者的痰液。所有分離的菌株采用BD Phoenix100儀器進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素藥敏試驗(yàn)采用K－B法，藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。用 WHONET5.6分析菌株藥敏情況。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）。

1.2 儀器與試劑 德國(guó)Eppendorf公司的PCR擴(kuò)增儀，Bio－Rad公司的凝膠成像儀。TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K、Hinf I均為TaKaRa公司產(chǎn)品。Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、10%十二烷基磺酸鈉（SDS）購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 細(xì)菌DNA模板制備 將菌株接種5mL LB肉湯，35℃培養(yǎng)18h。取菌液1 000μL，12 000r/min離心5min，細(xì)胞沉淀物以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗滌，SDS－蛋白酶K裂解后，利用酚－氯仿進(jìn)行抽提，乙醇洗滌后用TE緩沖液（10mmol/L Tris，1mmol/L乙二胺四乙酸）溶解DNA沉淀，于－20℃保存。

1.4 Ⅰ類整合子結(jié)構(gòu)研究 先采用PCR對(duì)59株銅綠假單胞菌進(jìn)行整合酶I基因擴(kuò)增，陽(yáng)性菌株進(jìn)一步對(duì)其可變區(qū)即整合子Ⅰ進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物和反應(yīng)體系均參照文獻(xiàn)［2］?？勺儏^(qū)陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性核酸片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP），所用反應(yīng)體系均為20μL，含10×H Buffer 2μL，Hinf I 5U，5μL陽(yáng)性PCR產(chǎn)物模板，加入滅菌去離子水至20 μL。37℃酶切消化1h后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并挑選不同譜型的PCR產(chǎn)物送深圳華大基因公司測(cè)序。

1.5 ISCR1結(jié)構(gòu)研究 先采用PCR對(duì)59株菌進(jìn)行ISCR1基因擴(kuò)增，陽(yáng)性菌株進(jìn)一步擴(kuò)增ISCR1可變區(qū)基因，所用引物均參照文獻(xiàn)［3］。

1.6 復(fù)雜性整合子結(jié)構(gòu)研究 對(duì)于整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)均陽(yáng)性的菌株，先針對(duì)整合子Ⅰ的3′保守區(qū)和ISCR1的5′保守區(qū)設(shè)計(jì)共同區(qū)引物，引物1為5′－GTA TTG CGC CGC TCT TAG AC－3′，引物2為5′－AAA CCA GCA TGG TTG GCT AC－3′。若擴(kuò)增陽(yáng)性，再針對(duì)整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物3為5′－TCC CGA GGT CAC CAA GAT－3′，引物4為5′－TTA CTC CCA AGG GTT CCA G－3′，擴(kuò)增從整合子Ⅰ可變區(qū)到ISCR1可變區(qū)之間的片段。

1.7 常見(jiàn)碳青霉烯酶基因檢測(cè) PCR檢測(cè)碳青霉烯酶基因KPC、NDM、IMP、VIM和SPM。所用引物均參照文獻(xiàn)［1，4］，各基因的陽(yáng)性對(duì)照株均為本課題組PCR檢測(cè)后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證過(guò)的臨床分離株。各基因陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物送深圳華大基因測(cè)序驗(yàn)證。

1.8 ERIC－PCR基因分型 ERIC－PCR引物序列 ERIC－2：AAG TAA GTA ACT GGG GTG AGC G，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，26℃退火2min，72℃延伸1 min，4個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，40℃退火1min，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

2 結(jié) 果

2.1 I類整合子結(jié)構(gòu) 59株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中，20株（34%）整合酶Ⅰ陽(yáng)性，17株（29%）整合子Ⅰ可變區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性，RFLP分型顯示，50株整合子Ⅰ陽(yáng)性菌株共分為3個(gè)譜型分別測(cè)序。測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，7株為A類型，攜帶氨基糖苷類耐藥（aacA4）；6株為B類型，攜帶氨基糖苷類耐藥（aadA7）；4株為C類型，攜帶氯霉素類和氨基糖苷類耐藥（catB3＋aacA4）基因盒。

2.2 ISCR1結(jié)構(gòu) 59株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中，9株（15%）ISCR1陽(yáng)性，5株（8%）檢測(cè)到可變區(qū)陽(yáng)性。RFLP分型顯示，5株為同一譜型，測(cè)序結(jié)果表明可變區(qū)攜帶基因盒喹諾酮耐藥（qnrA1）和β－內(nèi)酰胺類耐藥（ampR）。

2.3 復(fù)雜性整合子結(jié)構(gòu) 復(fù)雜性整合子驗(yàn)證結(jié)果顯示，1株整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)均陽(yáng)性的菌株共同區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性，進(jìn)一步針對(duì)整合子Ⅰ和ISCR1可變區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增也為陽(yáng)性，提示這株菌均攜帶一種復(fù)雜性Ⅰ類整合子，基因盒排列為catB3＋aacA4＋I(xiàn)SCR1＋qnrA1＋ampR。

2.4 常見(jiàn)碳青霉烯酶基因 59株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中3株檢出VIM－2基因，2株檢出IMP－1基因，未檢出其他碳青霉烯酶基因。

2.5 ERIC－PCR基因分型結(jié)果 59株菌株ERIC－PCR圖譜顯示電泳條帶集中分布在200～5 000bp，每株菌株都擴(kuò)出至少4個(gè)條帶。采用Quanlity One軟件進(jìn)行聚類分析，相似性聚類分析結(jié)果表明，59株菌株在80%的相似水平上被聚為52個(gè)類群。

3 討 論

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的重要條件致病菌，隨著能夠水解碳青霉烯類抗菌藥物金屬β－內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物及第3代頭孢菌素耐藥銅綠假單胞菌的分離率日漸增多，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大的困難［5］。對(duì)碳青霉烯類耐藥主要與其產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶（如金屬酶）有關(guān)，而且這些耐藥基因常位于整合子和ISCR等耐藥元件的可變區(qū)基因盒中。整合子是一種運(yùn)動(dòng)性的DNA分子，具有捕獲外源游離基因片段的功能，是細(xì)菌遺傳和變異的天然克隆和表達(dá)系統(tǒng)，臨床以I類常見(jiàn)［6］。ISCR1也是一種強(qiáng)大的耐藥基因捕獲元件，屬于IS1－like家族，通過(guò)滾環(huán)復(fù)制的方式轉(zhuǎn)作鄰近的耐藥基因，常位于普通整合子Ⅰ的3′末端［7］。

本院分離的59株碳青霉烯銅綠假單胞菌均為多重耐藥，研究發(fā)現(xiàn)整合子Ⅰ主要攜帶aacA4、aadA7和catB3，ISCR1主要攜帶qnrA1和ampR，復(fù)雜性整合子更是同時(shí)攜帶aacA4、catB3、qnrA1和ampR，提示整合子Ⅰ和ISCR1在銅綠假單胞菌介導(dǎo)多重耐藥方面有重要作用。59株菌株中5株攜帶金屬酶基因，攜帶率為8%，表明除了金屬酶的水解作用可以使銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類藥物產(chǎn)生抵抗之外，還有其他機(jī)制參與，如膜孔蛋白的缺失、外排泵的過(guò)度表達(dá)等［8］；同時(shí)也提示本院銅綠假單胞菌已有金屬酶產(chǎn)生，這和碳青霉烯類抗菌藥物在本院廣泛應(yīng)用密切相關(guān)，應(yīng)引起臨床和控制感染部門的高度關(guān)注，應(yīng)杜絕不合理使用碳青霉烯類抗菌藥物的現(xiàn)象。

銅綠假單胞菌是醫(yī)院內(nèi)感染的重要致病菌，醫(yī)院內(nèi)感染的原因主要是：（1）外源性交叉感染；（2）受自身免疫功能低下所致的內(nèi)源性感染。ERIC－PCR操作簡(jiǎn)單、分型效率高、價(jià)格低廉，非常適合于研究醫(yī)院內(nèi)感染傳播機(jī)制［9］。本院臨床分離的59株菌株均能擴(kuò)增出條帶，分辨率高，圖譜聚類分析顯示80%的相似水平上被聚為52個(gè)類群，基因型分散，未顯示親密的親緣關(guān)系，不存在克隆傳播現(xiàn)象，由此表明59例耐碳青霉烯銅綠假單胞菌感染患者均為散發(fā)，不存在暴發(fā)或流行。

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