楊 帆(綜述)，張 琪陳規(guī)劃(審校)

1.中山大學附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院生物治療中心，廣州 510630;2.肝臟疾病生物治療臨床轉化廣東普通高校重點實驗室，廣州 510630;3.中山大學附屬第三醫(yī)院肝臟外科，廣州 510630

原發(fā)性肝細胞癌(肝癌，hepatocellular cell carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，目前主要治療方法有手術治療、放療、化療及綜合治療等。由于肝癌起病隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，確診時已達晚期或發(fā)生遠處轉移，即使是手術切除后也容易復發(fā)，缺乏有效的治療藥物和手段，總的治療效果并不理想。生物治療作為繼手術、放療、化療后腫瘤治療的第四種模式，已顯示出了良好的應用前景。目前生物治療主要包括腫瘤非特異性小分子化合物免疫治療、過繼免疫治療、腫瘤疫苗治療、腫瘤單克隆抗體的免疫治療、分子靶向治療和基因治療等［2］。細胞免疫治療是指根據(jù)免疫學原理，利用細胞治療肝癌，它是生物治療的重要組成部分，受到越來越多的關注。細胞免疫治療按其作用機制又分為兩類:(1)給患者回輸經(jīng)過體外激活和擴增至一定數(shù)量后具有內(nèi)在抗腫瘤活性的自體免疫細胞，在體內(nèi)發(fā)揮殺傷腫瘤，ACT 的治療方法屬于被動細胞免疫治療;(2)給患者回輸能在體內(nèi)激發(fā)患者的特異性抗腫瘤免疫反應的細胞如回輸樹突狀細胞的樹突狀細胞，屬于主動細胞免疫治療。本文就肝癌常用的細胞免疫治療研究現(xiàn)狀和進展作一概述。

1 細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer，CIK)

CIK 細胞是人單個核細胞在體外經(jīng)多種細胞因子刺激后獲得的一群異質細胞，流式細胞儀進行免疫表型分析發(fā)現(xiàn)CD3+細胞、CD8+細胞較多，尤其是CD3+CD56+T 淋巴細胞。CIK 細胞同時具有T細胞和NK 細胞的標志［3］。Schmidt-Wolf［4］實驗證明，CIK 細胞起源于CD3+T 細胞而非CD56+NK 細胞。該細胞群是在多種細胞因子如IL-2、IFN-γ 及某些單克隆抗體(Anti-CD3McAb)的刺激下，由從外周血、骨髓或臍血中分離出來的單個核細胞在體外培養(yǎng)擴增而成，具有廣泛的非MHC 限制的、極強的溶瘤活性［5］。由于CIK 細胞具有高增殖能力和高細胞毒力且對正常骨髓細胞抑制輕微，可用于惡性腫瘤的細胞過繼免疫治療和自體造血干細胞移植時微小殘留病的凈化。

Huang 等［6］比較CIK 聯(lián)合經(jīng)導管肝動脈化療栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)及射頻消融(radiofrequency ablation，RFA)，與單獨序貫使用TACE 及RFA 對于肝癌的治療效果，HCC患者分為兩組，85 名患者接受TACE +RFA +CIK聯(lián)合治療，89 名患者接受TACE +RFA 治療，總體有效率分別為76.5%及79.8%。疾病控制率分別是95.3%及88.8%，結果并沒有顯著的差異，然而Kaplan-Meier 分析顯示TACE +RFA +CIK 組比起TACE+RFA 組有更長的生存期(分別是56個月及31個月，P=0.001)，CIK 細胞治療組患者沒有發(fā)生嚴重的副作用。因此，作者認為CIK 細胞治療是HCC 患者TACE 及RFA 之后防治肝癌復發(fā)和轉移的一項重要的治療手段，它能夠有效地提高患者的生活質量。Cui 等［7］對比了HCC 患者RFA 治療及聯(lián)合使用CIK 治療，同樣提示CIK 治療是一種安全有效的治療方式，能夠防止RFA 治療后HCC 的復發(fā)。Ma 等［8］為了探討CIK 對于肝癌患者的作用，對一系列CIK 隨機的臨床Ⅱ、Ⅲ期試驗利用肝癌和CIK 細胞作為關鍵詞進行檢索，分析結果表明CIK細胞治療對于肝癌有明顯的生存受益，對比CIK 及未進行CIK 組，CIK 治療組顯示出更長的無疾病進展生存，更好的疾病控制率和總反應率;同時CIK治療組病人顯示出更好的生活質量，HBV-DNA 的病毒載量及AFP 水平有明顯下降，另外對比了周圍血T 淋巴細胞的亞型，發(fā)現(xiàn)CD3+、CD4+、CD4+CD8+及CD3+CD4+T 細胞均高于未進行CIK 細胞治療組。

2 腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)

1986年Rosenberg 等［9］描述了一類從腫瘤組織中分離出來的具有殺腫瘤細胞特性的淋巴細胞，為CD3+CD56－CD8+的免疫表型，具有抗癌活性的T 淋巴細胞，并命名為腫瘤浸潤淋巴細胞。TIL 細胞是從手術切下腫瘤組織、腫瘤引流淋巴結、癌性胸腹水中獲得淋巴細胞，經(jīng)加IL-2 培養(yǎng)后，具有高效、特異、副作用小等優(yōu)點，對腫瘤細胞的殺傷有MHC 限制性，殺傷活性較淋巴因子激活的殺傷細胞(lymphokine-activated killer cells，LAK 細胞)強［10］。國內(nèi)外學者一系列研究表明HCC 患者TIL 浸潤的預后明顯優(yōu)于沒有明顯TIL 浸潤［11］。HCC 術后易于復發(fā)，為了探討術后的TIL 免疫治療是否降低癌癥的復發(fā)，Takayama T 等［12］通過對150 名手術切除HCC 患者進行過繼免疫治療，研究結果表明免疫治療明顯延長患者的生存期，同時減少HCC 復發(fā)。

提高TIL 殺傷功能的方法主要通過對T 細胞進行改造，具體方法有如下兩種。第一種方法是利用轉基因技術對T 細胞進行改造，克隆抗原特異性TCR 基因，通過病毒轉染使其在T 細胞表面高表達，改變抗原特異性T 細胞受體的α 及β 鏈，可有效提高其識別和殺傷腫瘤細胞的能力。Gehring等［13］為了研究是否TCR 基因的改變能夠重新建立慢性HBV 患者的特異性的T 細胞免疫，同時探討HBV-DNA 整合的HCC 細胞能否被基因改造的T細胞識別。應用載體介導的，HBV 特異性的TCR插入到T 細胞表面，研究結果表明經(jīng)過改造的T 細胞能夠靶向殺傷HBV 相關性HCC。由于利用病毒載體來插入外源性的HBV 特異性的TCR 到T 細胞在臨床試驗中比較復雜且昂貴，同時對于HBV 持續(xù)感染的患者有插入突變及潛在毒性的風險。Koh等［14］研發(fā)出一種更加安全實用的方法來治療HCC，他們利用電轉染編碼抗HBV 的TCR 的mRNA，24 h 后，80%的CD8+T 細胞表達出HBV 的TCR，表達的效率明顯高于通過逆轉錄病毒轉導(18%)。在HCC 異種移植物模型中，TCR 電轉的T 細胞有效的防止腫瘤的增殖及抑制腫瘤的生長。

第二種方法為嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)修飾TCR，將T 細胞表面TCR 改造為CAR。CAR 技術的基本原理是通過基因工程技術將識別腫瘤相關抗原(TAA)的單鏈抗體(scFv)和T 細胞的活化序列在體外進行基因重組，形成重組質粒，在體外通過轉染技術，轉染經(jīng)純化與大規(guī)模擴增后的T 細胞，稱之為CAR-T 細胞，使淋巴細胞能通過非MHC 限制性的方式識別特定抗原，增強其識別和殺傷腫瘤的能力。CAR 的基本骨架包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3 部分，胞外區(qū)主要是單克隆抗體的單鏈可變區(qū)序列(scFv)，抑或激素的信號肽細胞因子膜受體的胞外區(qū)等;胞內(nèi)區(qū)為信號轉導部分，主要是T 細胞受體(TCR)/CD3 的鏈免疫球蛋白Fc 受體Fc R I 的鏈或CD3-鏈;而跨膜區(qū)可來源于同一分子或為1 型跨膜蛋白，如CD4，CD8 或CD28［15］。隨著技術的不斷改進，CAR 現(xiàn)已有三代，第一代CAR 并不能延長T 細胞的生存時間;第二代CAR 增加了共刺激信號如CD28、CD137(41-BB)、CD134(OX40)、ICOS 等，以刺激T 細胞的增殖，體內(nèi)外實驗表明第二代CAR-T 細胞的功能較第一代明顯增強;第三代CAR 整合了2個以上的共刺激分子以期望能進一步增強T 細胞的活化［16，17］為了研究表達有乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)特異性受體的T 細胞能否直接殺傷HBV 病毒，將CD8+T 細胞表面TCR 改造成連有HBV 膜蛋白嵌合抗原受體，并將改造后的CD8+細胞回輸HBV 感染小鼠，發(fā)現(xiàn)能夠很好地抑制HBV 的復制，同時對于小鼠肝臟的損傷小，這種CAR 改造的T細胞能夠不僅僅能有效清除HBV，同時有助于防止肝癌的進展。

3 自然殺傷(natural killer，NK)細胞

NK 是細胞瑞典免疫學家Kiessling 在20 世紀70年代發(fā)現(xiàn)的一類大顆粒淋巴細胞，它是天然免疫的主要細胞，具有抗腫瘤，抗感染和免疫調節(jié)等功能。人的NK 細胞是CD3－CD56+淋巴細胞。目前有關NK 細胞在腫瘤免疫治療的研究主要集中在自體NK 細胞過繼免疫治療、異體NK 細胞過繼免疫治療及基因修飾NK 細胞免疫治療等［18］。

自體NK 細胞輸注安全，對治療腫瘤也取得了一定的療效，但NK 細胞短期活化對細胞表型和功能的恢復不夠，自體NK 細胞輸注要發(fā)揮臨床作用可能需要長期的體外活化，發(fā)現(xiàn)長期活化NK 細胞對自身腫瘤細胞的殺傷活性明顯高于短期活化，應進一步完善與提高NK 細胞體外活化和擴增技術［19］。異體NK 細胞過繼免疫治療是NK 細胞來源于異體臍帶血、NK 細胞系或異體去淋巴細胞液在體外分離出NK 細胞并擴增培養(yǎng)。異體NK 細胞，有利于殺傷表達有自身MHCI 分子的腫瘤細胞，同時為了防止移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)發(fā)生，供體一般要預先把T 淋巴細胞去除，僅留下NK 細胞［20］?；蛐揎桸K 細胞免疫治療就是利用分子生物學技術對NK 細胞進行改造，增強其殺傷腫瘤的功能。Jiang 等［21］利用電轉化技術將IFN-α 基因轉入NK 細胞系中，并觀察在體內(nèi)外經(jīng)過IFN-α 修飾的NK 細胞對于HCC 的效應，結果表明經(jīng)過修飾過的NK 細胞中細胞毒性相關的一些基因如穿孔素、粒酶B、Fas 配體上調。細胞分泌的TNF-α 及IFN-γ 能夠增加Fas 的表達以攻擊HCC 細胞，同時增加NK 細胞介導的HCC 細胞溶解作用，在異種移植瘤模型中IFN-α 修飾的NK 細胞能夠有效的延長種植有HCC 移植瘤裸鼠的生存期。因此，作者認為IFN-α 修飾的NK 細胞能有望成為將來肝癌免疫治療的重要方法。

4 樹突狀細胞(dendritic cell，DC)

DC 疫苗是瘤細胞或與瘤細胞融合產(chǎn)物，或采用肽疫苗，即分離純化膜表面抗原肽或人工合成的肽，與正常人的DC 或患者自身DC 體外共培養(yǎng)，再回輸至患者體內(nèi)，重新讓DC 有效激活細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)介導的免疫反應?？商岣吆闪鏊拗髅庖咝毎麑δ[瘤細胞的毒性，誘發(fā)宿主對腫瘤特異抗原的特異性免疫應答。

DC 能直接活化CD4+、CD8+T 淋巴細胞，產(chǎn)生抗原特異性細胞及體液免疫應答反應。DC 具有非特異性免疫效應功能，可殺傷多種新鮮分離或培養(yǎng)的腫瘤細胞。DC 作為功能最強的抗原呈遞細胞，是機體免疫反應的始動者，因此，在以DC 為基礎的治療方案中，DC 的抗原遞呈是T、B 細胞發(fā)揮免疫反應的先決條件，借助DC 高表達的主要組織相容性復合體Ⅰ、Ⅱ類分子所遞呈的腫瘤抗原肽，聯(lián)合CD80、B86、CD40 分子共同作用，充分激活T 細胞。初始型T 細胞接受DC 遞呈的抗原后活化并增殖，促進其在腫瘤部位聚集以執(zhí)行免疫功能［22］。DC 為基礎的細胞治療屬于腫瘤疫苗治療，由于疫苗治療具有特異性、在體內(nèi)免疫效應維持時間長等優(yōu)點，目前已成為研究熱點。DC 疫苗在細胞治療中起著重要作用，近年來DC 疫苗在肝癌治療中顯示出良好的應用前景。

Palmer 等［23］進行一項Ⅱ期臨床試驗來評價靜脈輸入自體經(jīng)過肝癌細胞系(HepG2)刺激成熟的樹突狀細胞對于進展性HCC 的安全及有效性。研究結果表明134例DC 回輸患者中沒有發(fā)現(xiàn)有明顯毒性，同時對25例進行了3 次以上治療的患者進行臨床評價，放射學的基本控制率為28%，其中17例患者血漿AFP ＞1000 ng/ml，經(jīng)過治療后AFP 降到小于30% 的基線水平，其中1例患者AFP 小于10%基線水平。因此，從放射學及血清學均說明樹突狀細胞疫苗對于肝癌是一種安全及可耐受的抗腫瘤治療。El Ansary 等［24］等對于30例無法接受放射治療及局部治療的患者，15例患者接受肝癌細胞系的裂解產(chǎn)物負載的DC 疫苗治療，15例患者接受一般支持治療。結果表明接受疫苗治療患者的總體生存期提高了，同樣說明了DC 疫苗對于肝癌是安全可耐受的腫瘤治療方式。Tada 等［25］為了評價腫瘤相關抗原負載的DC 對HCC 的安全，可行及有效，α-甲胎蛋白、glypican-3 及MGGE-1 重組蛋白負載DC 成熟，DC 于腹股溝淋巴結皮下注射，結果表明對于5 名試驗者是安全可耐受的，并且都能對腫瘤相關抗原產(chǎn)生T 細胞反應。

5 展望

肝癌治療由單一治療發(fā)展到綜合治療是大勢所趨，免疫細胞治療配合手術切除、介入治療、射頻治療等常規(guī)肝癌治療手段，有利于提高肝癌患者生活質量，減少復發(fā)率，延長生存期。隨著細胞治療技術不斷改進，細胞免疫治療將充分發(fā)揮其療效好、不良反應小的優(yōu)點，在肝癌治療中將起到愈來愈重要的作用。

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