胡媛媛，馬 良，2，*，張宇昊，3

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（重慶），重慶400716；3.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶400716）

柑橘是世界產(chǎn)量最大的水果，也是我國主要種植水果之一。柑橘在生長、采收、貯藏、運輸、銷售等各個過程，易受到病原微生物污染，產(chǎn)生并積累各種生物毒素。目前柑橘常見病害有青綠霉病，黑腐病，酸腐病，蒂腐病，炭疽病等。受柑橘生長條件的不同以及外界因素影響，病害主要發(fā)生在果實采收期和/或貯藏期，造成柑橘的大量腐爛，并產(chǎn)生代謝毒素，其中最主要的真菌毒素包括展青霉素（patulin，PAT），橘青霉素（citrinin，CIT），鏈格孢霉毒素（Alternaria mycotoxins）。目前，針對水果真菌毒素的研究主要集中在蘋果及其產(chǎn)品中展青霉素和赭曲霉毒素（ochratoxin，OT）的研究，柑橘類水果中真菌毒素的研究很少，尤其是對CIT，鏈格孢霉素等的檢測標(biāo)準(zhǔn)、限量標(biāo)準(zhǔn)以及柑橘類水果中真菌毒素產(chǎn)生、污染和分布等方面均缺乏基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和系統(tǒng)研究。因此對柑橘中主要真菌毒素檢測、分布、污染控制等技術(shù)的研究，對柑橘及其產(chǎn)品的質(zhì)量安全具有極其重要的意義。

1 影響柑橘質(zhì)量安全的主要真菌毒素

柑橘采后貯藏階段是病害污染和毒素產(chǎn)生的主要階段。貯藏期的病害可分為貯藏期侵染病害和采前侵染病害。貯藏期侵染病害包括青霉病、綠霉病等，采前侵染病害包括柑橘黑腐病、柑橘褐腐病、黑色蒂腐病、炭疽病等，其中青綠霉病和柑橘黑腐病是產(chǎn)真菌毒素的主要病害[1]。意大利青霉和指狀青霉是引發(fā)柑橘青、綠霉病的主要霉菌，它們的最適生長溫度在25℃左右，最適水分活度為0.95，因此只要溫濕適宜，就會引發(fā)柑橘的腐爛并產(chǎn)生大量真菌毒素，如展青霉素、橘青霉素、青霉酸等。柑橘黑腐病是由鏈格孢霉引起的，它的最低耐受溫度可達-5℃左右，在采收前以菌絲體或分生孢子的形式吸附在果實表面，當(dāng)溫度適宜時從果實傷口或果蒂處侵入致病，產(chǎn)生大量鏈格孢霉素[2]。

青綠霉病從果實表面開始侵染柑橘，并存在交叉侵染的情況，在柑橘病害中具有高發(fā)性，柑橘黑腐病則主要是從果蒂處開始侵染，由內(nèi)部開始破壞果實組織，具有隱藏性。因此它們是影響柑橘質(zhì)量安全的主要病害，而它們所產(chǎn)生的真菌毒素應(yīng)成為控制柑橘類產(chǎn)品質(zhì)量安全的重點監(jiān)控對象。

1.1 展青霉素

展青霉素（patulin，PAT）又名棒曲霉素，由曲霉菌、青霉菌和絲衣霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，是水果中常見真菌毒素。PAT是一種低分子量的半縮醛內(nèi)酯，在柑橘中主要由指狀青霉和意大利青霉產(chǎn)生，在兩種霉菌受到抑制時，也可由烏來青霉產(chǎn)生[3]。青霉菌屬的孢子利用柑橘傷口處的營養(yǎng)物質(zhì)萌發(fā)形成菌絲，能夠快速繁殖并產(chǎn)生毒素，溶解傷口附近的白皮層，再溶解黃皮層，完成對果實組織細(xì)胞的降解[4]。實驗證明甜橙、克萊門柚、溫州蜜柑中的黃烷酮橘皮苷，葡萄柚中的柚苷，以及檸檬中的黃烷酮橘皮苷和黃烷酮葉香木甙含量都會影響柑橘對青霉菌的敏感度，特別是甜橙、溫州蜜柑中含高濃度的多甲基黃酮，被認(rèn)為是對青霉菌最不敏感品種，因此展青霉素污染較少[5]。一般情況下PAT存在于青綠霉菌引發(fā)的腐爛部位處，且腐爛程度越大，PAT的濃度越高[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，PAT在水果中擴散可能滲透到腐爛部位周圍幾厘米處，擴散速度與水果的種類、腐爛面積、成熟程度、含水率、糖酸比等因素有關(guān)，質(zhì)地越松軟，糖酸比越高，PAT的擴散速度越快，水果品種不同，也會影響PAT的擴散速度[6-7]。

PAT經(jīng)不同途徑接觸動物，LD50為15～25mg/kg，具有急性毒性，包括對動物的肺、腦水腫、肝臟、脾臟、腎的損害和免疫系統(tǒng)的毒害作用；也具有慢性毒性，表現(xiàn)在對動物的細(xì)胞毒性，基因毒性和免疫毒性。對巰基有強親和力，可與含巰基的蛋白和多肽反應(yīng)，破壞DNA單鏈和雙鏈，從而抑制DNA和RNA的合成，也可抑制多種酶活性，特別是一些生化指標(biāo)中的酶，如堿性磷酸酶、二磷酸果糖酶和己糖激酶等。在相當(dāng)大劑量范圍內(nèi)，可使小鼠大腦、腎臟、肝臟中DNA鏈破裂，其中大腦是最主要的靶器官[8]。此外，對成年哺乳動物和胚胎期動物的腎臟也有毒害作用[9]。直接接觸皮膚，可引起DNA損傷，從而造成細(xì)胞周期阻滯和內(nèi)部介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，積累大量具有皮膚毒性的聚胺產(chǎn)物[10]。

鑒于PAT的遺傳毒性和免疫毒性等危害，世界各國對PAT在水果中的限量標(biāo)準(zhǔn)大多規(guī)定在50μg/kg以內(nèi)，主要以蘋果和山楂作為主要限制對象，WHO規(guī)定在蘋果汁中PAT的限量值為50μg/kg，歐盟關(guān)于PAT最新規(guī)定中蘋果泥中最大允許限量為25μg/kg，特別指出嬰兒食品中最大限量不超過10μg/kg，我國規(guī)定在蘋果和山楂制品中限量值為50μg/kg。目前，國內(nèi)外對柑橘屬中PAT的限量標(biāo)準(zhǔn)屬于空白，亟待針對不同柑橘種類、不同食用方式等進行相關(guān)PAT限量標(biāo)準(zhǔn)的研究和完善。

1.2 橘青霉素

橘青霉素（citrinin，CIT）是一類醌甲基化合物，由橘青霉、土曲霉、擴展青霉、純綠青霉和一些紅曲霉屬產(chǎn)生。柑橘果實常常遭到橘青霉、土曲霉、擴展青霉、意大利青霉污染而產(chǎn)生CIT。它是一種酸性的淡黃色晶體，在250nm和330nm處有最大紫外吸收，熔點為172℃。CIT有強抑菌效果，可作為抗生素使用[11]。但它對動物和人類具有腎毒性、基因毒性、致癌性、胚胎毒性，它是一種腎毒素，會破壞動物腎小管，毒害胚胎期動物的腎臟，是巴爾干腎病的潛在的病原體[9]。它還會對小鼠生殖器官有一定的損害[12]。其胚胎毒性，主要體現(xiàn)在加快了細(xì)胞凋亡，使胎兒體重減少，用CIT處理過的胚囊的移植成功率大大降低[13]。此外，CIT能與其他毒素發(fā)生協(xié)同作用，它和赭曲霉素都是作為具有腎毒性的致癌物質(zhì)，在同時存在時可極大增強基因毒性，加速DNA鏈的斷裂和抑制細(xì)胞增殖[14]。

CIT在世界上沒有統(tǒng)一的限量標(biāo)準(zhǔn)，主要原因是沒有合適的常規(guī)分析方法。另外，加工過程中不同的加工技術(shù)會對CIT及其含量造成影響，也造成了CIT限量標(biāo)準(zhǔn)制定具有相當(dāng)?shù)睦щy。如，加工過程中可利用CIT的螯合能力和對pH和溫度敏感性，進行食物中CIT的有效脫除[15]。但鮮果仍是柑橘果品最重要的食用方式之一，CIT具有的毒性及其對柑橘鮮果廣泛的污染一直以來嚴(yán)重威脅著柑橘的消費安全。

1.3 鏈格孢霉素

鏈格孢霉素是由鏈格孢霉產(chǎn)生的一系列代謝產(chǎn)物，主要包括細(xì)交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）、鏈格孢酚（alternariol，AOH）、鏈格孢酚甲基醚（alternariolmethyl ether，AME）、細(xì)格菌毒素、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（altertoxinⅠ、Ⅱ、Ⅲ，ATX-Ⅰ、ATX-Ⅱ、ATX-Ⅲ）和AAL毒素（AAL-toxin）。其中TeA、AOH、AME均在柑橘類水果中檢出，是污染柑橘的主要鏈格孢霉素[16]。不同品種的柑橘，對柑橘鏈格孢的敏感性也有所差異，以丹西紅桔和王柑為親本的雜交產(chǎn)物、葡萄柚、克里曼朋橘、皇帝柑極易感染柑橘鏈格孢霉，溫州蜜橘和橙類品種（西班牙橙除外）表現(xiàn)出輕微的敏感性，檸檬和酸橙類品種（墨西哥酸橙輕微敏感）不易感染鏈格孢霉菌[17]。

鏈格孢菌在不同柑橘中的主要侵染方式不同，造成鏈格孢霉毒素在不同品種中分布情況不同。有研究報道，甜橙、檸檬類柑橘以蒂部侵入為主，而溫州蜜柑類寬皮柑橘，以果皮侵染為主[18]。因此甜橙、檸檬類柑橘果實內(nèi)部的鏈格孢霉素含量可能比外部高，溫州蜜柑類寬皮柑橘果實外部毒素含量可能高于內(nèi)部。類似鏈格孢霉的污染造成果實表面特征不能反映果實的實際質(zhì)量，增加了柑橘鮮果、果皮類產(chǎn)品等安全風(fēng)險。雖然柑橘鮮果含有果皮、白皮層、果肉，可有效隔絕病原微生物及其毒素對果肉的侵害和污染，但柑橘組織損傷時，這些污染是無法避免的[19]。Stinson等[20]在橙子和檸檬中發(fā)現(xiàn)了TeA、AOH和AME，其中TeA濃度分別為61.1和48.8μg/g，AOH和AME在柑橘中濃度分別為41、2.8μg/g，且橙子中毒素含量普遍高于檸檬。

TeA屬于四氨基酸衍生物，具有抗菌活性，是一種水溶性鏈格孢霉素，雄性小鼠經(jīng)口LD50=182mg/kg，雌性小鼠經(jīng)口LD50=81mg/kg，被認(rèn)為是所有鏈格孢霉代謝產(chǎn)物中毒性最強的毒素[21]。它可以抑制蛋白合成，抑制皮膚腫瘤惡化[22]。它也是一種天然植物毒素，表現(xiàn)在干擾光合系統(tǒng)Ⅱ中酶電子的接受傳遞，從而抑制光合系統(tǒng)Ⅱ的活性[23]。AOH和AME屬于苯并吡喃酮衍生物，具有遺傳毒性，單一TeA在200μmol/L下對DNA無明顯破壞作用，但三種毒素混合具有協(xié)同作用，對DNA的破壞作用遠(yuǎn)超過單一組分效果之和[21]。也有報道AOH、AME、TeA在鏈格孢霉素致突變作用中，只起到小部分作用，并不是主要致突變成分[24]。Fatma等[25]利用人體結(jié)腸癌細(xì)胞，研究了AOH的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)AOH通過激活細(xì)胞中線粒體造成細(xì)胞凋亡從而降低細(xì)胞活性。

越來越多的實驗和報道證實鏈格孢霉素在柑橘污染中具普遍性，且對哺乳動物具有較強的遺傳危害。但是目前國內(nèi)外尚無各種鏈格孢霉素限量的相關(guān)法律法規(guī)，需要對相關(guān)領(lǐng)域進行研究。

2 水果檢測的主要真菌毒素

水果中真菌毒素檢測普遍使用的方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、免疫學(xué)方法等，液相色譜法是應(yīng)用最廣泛的方法，也是我國果品中真菌毒素檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。由于TLC檢測靈敏度低，且在羥甲基糠醛存在時對真菌毒素的分離效果差，因此只能用于定性或半定量分析。液相色譜應(yīng)用后，TLC逐步淡出水果檢測領(lǐng)域，目前已極少應(yīng)用在水果中真菌毒素檢測。與此同時，一些新的檢測手段也開始應(yīng)用于水果的毒素檢測，如高效毛細(xì)管電泳法，近紅外檢測技術(shù)等。

目前這些檢測技術(shù)主要用于蘋果、梨、橄欖等水果中真菌毒素的檢測，而針對柑橘中真菌毒素檢測技術(shù)的系統(tǒng)研究屬于空白。柑橘本身含有黃酮類化合物，故其果汁大多為黃色，在進行檢測時，尤其是進行色譜檢測時，容易造成干擾，影響分析結(jié)果。因此，綜合各種水果中真菌毒素檢測技術(shù)的研究進展，與柑橘果實本身的基質(zhì)特性以及柑橘產(chǎn)業(yè)相結(jié)合，對今后柑橘產(chǎn)業(yè)鏈中真菌毒素的檢測技術(shù)的研究以及真菌毒素的監(jiān)控具有極其重大的意義。

2.1 色譜技術(shù)

2.1.1 液相色譜技術(shù)（liquid chromatography，LC） 影響液相檢測結(jié)果的主要是樣品前處理方式和檢測器類型，利用液相色譜法檢測水果真菌毒素常用檢測器是熒光檢測器和紫外檢測器，不同檢測器對不同毒素的靈敏度不同。研究發(fā)現(xiàn)，熒光檢測CIT結(jié)果的靈敏度是紫外檢測結(jié)果的100倍[26]，而在鏈格孢霉素檢測時，從檢出限到回收率，紫外檢測的結(jié)果均優(yōu)于熒光檢測[27]。Scott等[28]將蔓越橘汁過固相萃取柱，利用反相LC-UV檢測果汁中的鏈格孢霉素，AOH和AME的檢出限均在0.4μg/L，回收率分別為93%和81%。陳月萌等[29]建立了同時檢測水果中三種鏈格孢霉素的高效液相色譜-熒光分析方法，利用固相萃取作為樣品前處理手段，成功檢測出水果中殘留鏈格孢霉素，回收率均在78.2%～103.6%范圍內(nèi)。Li等[30]用蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light-scattering detector，ELDS）代替了傳統(tǒng)的紫外檢測器，與液相色譜儀結(jié)合，用于檢測鏈格孢霉素，線性響應(yīng)范圍在0.4～4μg之間，檢出限在6μg/m L，與經(jīng)衍生處理后HPLC檢測方法相比，HPLC-ELDS方法的靈敏度更高。液相色譜分析前，一般需要對待檢物質(zhì)進行分離純化濃縮等前處理，有的真菌毒素還需要衍生處理，以提高檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。選擇不同的萃取方式也會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，常見前處理方法包括液液萃取、傳統(tǒng)固相萃取、免疫親和柱富集等，它們各有其優(yōu)勢與不足。果汁中的PAT經(jīng)固相萃取后，其濃度是液液萃取效果的十倍左右，大大增強了檢測靈敏度[31]。同時，不同萃取方法適用的產(chǎn)品不同，基質(zhì)分散固相萃取適用于對濃縮果汁PAT監(jiān)控，而固相萃取更適用于稀釋果汁的分析。Tokusoglu等[32]利用免疫親和柱-高效液相色譜-熒光檢測器同時檢測水果中的CIT和OT，平均回收率均在90%以上，檢出限均為0.05μg/kg，可用于水果及制品的快速檢測。近年來，水果毒素分析中開始引入分子印跡技術(shù)，結(jié)合固相萃取，建立了一種改良的前處理方法，即分子印跡-固相萃?。╩olecularly imprinted solid phase extraction，MISPE）。它是一種基于固相萃取原理的新型萃取技術(shù)，分子印跡聚合物通過嫁接的聚合方法，吸附在二氧化硅珠上，用于PAT的提取，最大可吸附93.97%的PAT，且回收率超過90%，是一種良好的新型萃取方法[33]。Guo等[34]以1-羥基-2-萘酸為模板制備CIT分子印跡聚合物，結(jié)合液相色譜檢測CIT，結(jié)果表明這種聚合物可以高選擇性吸附CIT，回收率為86.7%～97.7%。

2.1.2 液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS） 盡管液相色譜技術(shù)能夠良好檢測水果中的鏈格孢霉素，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合檢測，不僅可以避免衍生，縮短分析時間，還能提高對毒素的分辨率。當(dāng)前檢測果汁PAT時，多采用固相萃取、HPLC和MS結(jié)合，回收率可達90%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在1.5%～7.5%之間，檢測靈敏度高[35]。Song等[36]將固相萃取與HPLC及MS相結(jié)合進行果汁中PAT、OTA、AFB1含量檢測，定量限最低達0.8μg/kg，回收率在66%～127%范圍內(nèi)。Rodrigo等[37]采用HPLCMS對金桔的外果皮和中果皮（白色組織）中的AOH、AME進行檢測，檢測結(jié)果表現(xiàn)出良好線性范圍0.5～20.0mg/kg，相關(guān)性為0.997，檢測限和定量限分別小于0.13、0.5μg/kg。由于TeA是一種強酸，可以與金屬發(fā)生螯合，特別是在分析含多種干擾物的基質(zhì)時，極易影響儀器分析的準(zhǔn)確性。

雖然LC-MS相較于LC提高了檢測靈敏度，但是TeA類物質(zhì)衍生時仍然存在這類問題，因此同位素薄弱化分析（stable isotope dilution assay，SIDA）作為一種優(yōu)化手段，用于水果中真菌毒素檢測。它主要是通過合成一種穩(wěn)定的同位素標(biāo)記物，作為待檢物質(zhì)內(nèi)標(biāo)物，以提高檢測的準(zhǔn)確度。Stefan等[38]將同位素薄弱分析方法用于檢測TeA，首先合成穩(wěn)定的同位素標(biāo)記物[13C6，15N]-TeA作為對應(yīng)毒素的內(nèi)標(biāo)物，進行LCMS掃描，紫外檢測器檢測，實驗表明，該方法即彌補衍生反應(yīng)的不完整性，還能簡化操作，增加檢測結(jié)果的可靠性。有研究表明SIDA引入水果毒素分析，再結(jié)合LC-MS檢測水果中的PAT含量回收率高達94%～104%，符合歐盟檢測最高要求水平[39]。

此外，大氣壓化學(xué)電離（atmospheric pressure chem ical ionization，APCI）也被引入LC-MS檢測中，可用于檢測五種鏈格孢霉素在果蔬汁產(chǎn)品中的含量，僅需簡單萃取處理樣品，大大節(jié)省了檢測時間，是一種新型檢測方法[40]。

2.1.3 氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同樣可以用于檢測水果中PAT，該方法減少了濃縮和凈化的步驟，有效縮短了前處理時間，但檢出限偏高，雖然GC-MS對PAT有良好分辨率，可在分析中方便識別目標(biāo)物，但精密度、重復(fù)性、檢出限和成本等因素綜合比較，HPLC-DAD更適用于日常分析研究[41]。在采用GC-MS方法檢測PAT時，需選擇一定內(nèi)標(biāo)物，如Cunha等以13C5-7PAT為內(nèi)標(biāo)物檢測橙汁中的PAT，Xiao等以3-硝基苯甲醇為內(nèi)標(biāo)檢測果汁中PAT，這樣可以彌補目標(biāo)分析物的損失，抑制樣品基質(zhì)影響[42-43]。

2.2 免疫速測方法

與液相色譜不同，免疫分析法不需要考慮凈化、富集、衍生等問題，也無需考慮鏈格孢霉素?zé)晒庵档娜狈Γ粡V泛用于檢測展青霉素和鏈格孢霉素。同時，它也是檢測水果中CIT的主要方法，雖然液相色譜也適用于CIT的檢測，但是目前大多用于谷物、動物飼料等原料的CIT檢測，而在水果中的應(yīng)用較少。

目前，免疫速測方法檢測水果真菌毒素，使用最多的是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），也可使用熒光免疫分析、膠體金免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)等。De Champdore等[44]建立了一種新型競爭性熒光偏振免疫檢測方法檢測PAT，這種分析方法是基于在PAT固定化衍生物和樣品PAT之間建立一種競爭結(jié)合熒光標(biāo)記抗體的競爭關(guān)系。通過檢測PAT與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合過程中熒光基團發(fā)射的熒光值，判定樣品中PAT含量，檢出限為10μg/L，適用于PAT的微量檢測。Yvonne[45]和Madeleine等[46]制備出AOH、TeA的單克隆抗體和多克隆抗體，利用直接競爭ELISA法檢測水果及其飲料中的AOH、TeA，其中AOH的檢測限可達1～2μg/kg，而TeA在水果中的檢測范圍達25～150μg/kg。

一些基于特異性抗體的快速檢測設(shè)備同樣被用于水果中PAT、CIT和鏈格孢霉素的檢測，它們不僅可作為HPLC的前處理方法，如免疫親和柱-液相色譜的應(yīng)用，也有一些可直接用于檢測，如ELISA試劑盒、生物傳感器等。Qian等[47]將CIT抗體固定在改良固定相電極表面開發(fā)出一種新型電壓免疫感應(yīng)器，測定CIT含量，分析結(jié)果無明顯交叉反應(yīng)，線性范圍介于25～100μg/m L。此外，微流體免疫傳感器也可用于檢測CIT，它是利用特異競爭免疫分析方法，引發(fā)氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流，根據(jù)電流的強弱判斷待測物中CIT的數(shù)量。這種微流體免疫傳感器的適用范圍在0.5～50ng/m L，且整個檢測過程僅需45m in，與目前其他分析方法，特別是色譜分析相比，具有耗時短、選擇性強、靈敏度高的特點[48]。

雖然免疫速測方法具備靈敏度高、耗時短、特異性強等優(yōu)點，但真菌毒素的單克隆抗體制備過程較復(fù)雜，成本較高，且檢測對象單一，不利于免疫方法的普及。因此，研究出一種可同時檢測污染并可對水果主要真菌毒素的速測方法是今后研究的熱點之一。

2.3 高效毛細(xì)管電泳技術(shù)（high performance capillary electrophoresis，HPCE）

高效毛細(xì)管電泳是集電泳和色譜為一體的新型液相分離技術(shù)，其分析速度快、靈敏度高、進樣量少、再現(xiàn)性佳、能直接進樣，易于自動化操作，作為一種重要的分離分析方法被廣泛應(yīng)用。

目前，膠束毛細(xì)管電泳法（micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC或MECC）已經(jīng)成功用于果汁中PAT檢測，且從回收率、精密度、檢出限等方面均優(yōu)于HPLC方法[49-50]。有研究中也提到優(yōu)化后的微乳液毛細(xì)管電動色譜（microemulsion electrokinetic chromatography，MEEKC）和毛細(xì)管區(qū)帶電泳也可用于果汁PAT的檢測，到達理想的分離效果[51-52]。因此，HPCE技術(shù)在各種柑橘鮮果及制品PAT及各種毒素檢測中，將發(fā)揮越來越重要的作用。

2.4 無損光譜檢測技術(shù)

非侵入無損光譜檢測技術(shù)包括穩(wěn)態(tài)和時間分辨熒光光譜，紫外/可見/近紅外光譜，雙光子誘導(dǎo)熒光光譜。它已被用于谷物及其制品中真菌及其毒素檢測，但在柑橘等水果中還處于檢測其內(nèi)部品質(zhì)的階段。其中紫外、熒光檢測器常與HPLC聯(lián)用，近紅外光譜技術(shù)開始用于水果及其制品的PAT的研究，而雙光子誘導(dǎo)熒光光譜，由于在雙光子激發(fā)條件下可顯著降低基質(zhì)成分的背景輻射干擾，可用于葡萄酒和啤酒真菌毒素的定性定量檢測[53]。

近年來，近紅外光譜檢測食品真菌毒素的研究多用于谷物、飼料等食品中，它區(qū)別與以往的化學(xué)檢測，作用對象是檢測樣品本身，無需進行處理，既能節(jié)省時間，又能降低成本，但是在水果領(lǐng)域中的應(yīng)用有待提高[54-55]。張亮[56]采用傅立葉近紅外光譜法分析PAT，并建立了近紅外光譜分析法檢測不同體系中PAT的檢測模型，在濃縮蘋果汁中PAT平均回收率達99.97%，具有高精密度和準(zhǔn)確度，可用于濃縮果汁的快速檢測。值得注意的是，一方面，光譜法是通過光的反射或透射來檢測的，因而其對表面污染的區(qū)分效果比深層污染更好；另一方面，由于水果的成分復(fù)雜，某些物質(zhì)的吸收峰可能會覆蓋毒素的部分特征吸收峰，只能通過加大樣品量來增加模型穩(wěn)定性。因此，近紅外光譜技術(shù)檢測水果中真菌毒素還需要進一步研究。

2.5 PCR技術(shù)

目前有報道采用各種分子生物學(xué)技術(shù)也可進行真菌毒素的快速鑒定。主要是通過PCR技術(shù)識別真菌毒素產(chǎn)生菌DNA片段，從而判斷該水果是否可能含有該真菌產(chǎn)生的毒素[57]。M iguel等[58]利用鏈格孢霉與其產(chǎn)生毒素含量正相關(guān)的關(guān)系，通過采用基于序列遺傳標(biāo)記的PCR技術(shù)識別水果中鏈格孢霉的DNA，從而判斷水果是否被鏈格孢霉素污染。也有研究通過檢測PAT、OTA的復(fù)合PCR片段檢測PAT、OTA產(chǎn)生菌的DNA，判定食物中致病菌污染情況[59-60]。但是，這種技術(shù)同樣存在缺陷，如未經(jīng)過前處理的PCR檢測，因其不能有效區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，可能過高估計產(chǎn)毒菌的含量，從而影響對毒素污染食品的檢測結(jié)果。為此，Ana等[61]研究出一種新型的核酸染色插層法作為一種前處理手段，用以克服這類問題，但是該前處理中用到的DNA結(jié)合染料對細(xì)胞也可能造成一定的損害，因此選擇適當(dāng)?shù)那疤幚矸椒ê驮噭┮彩悄壳癙CR技術(shù)應(yīng)用于水果中真菌毒素檢測的難點之一。

3 展望與討論

目前國內(nèi)外缺乏統(tǒng)一的針對柑橘類鮮果及食品中毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)，也沒有針對可能污染柑橘毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。相關(guān)柑橘的研究主要集中在病害機理、病蟲害防治、貯藏保鮮等方面，缺乏針對侵染后柑橘中真菌毒素的產(chǎn)生、污染分布和控制等的系統(tǒng)性研究。

在病蟲害防治研究中化學(xué)防治仍然是目前使用最廣泛的方法，其中殺菌劑對真菌毒素的影響，并沒有引起普遍關(guān)注。近年來，一些殺菌劑被報道和證明不僅不會抑制真菌毒素的生長，還會刺激其含量的升高[62]。殺菌劑與真菌毒素的互作關(guān)系及機理不明，使用殺菌劑無法保證柑橘類食品的食用安全性。因此，了解真菌毒素在柑橘中的產(chǎn)生、污染、分布情況，對有效控制柑橘水果安全有重要意義。

目前柑橘真菌毒素污染控制主要存在以下三點問題：

工業(yè)生產(chǎn)橙汁，檸檬汁等果汁生產(chǎn)過程中主要是通過剔除腐爛部分降低毒素及病菌污染的風(fēng)險，但是這并不能完全消除風(fēng)險。有的病原菌，如鏈格孢菌屬可使柑橘果實內(nèi)部腐爛而表皮無明顯變化，不能通過沖洗，分揀操作去除毒素，增加了果汁類產(chǎn)品的安全隱患。

柑橘中真菌毒素主要集中在果皮，由于柑橘屬水果以鮮果果肉或果汁為傳統(tǒng)食用方式，果皮棄去或用于制藥、陳皮、飼料等，因此過去柑橘真菌毒素污染風(fēng)險相對較低。但是隨著柑橘果肉和果皮應(yīng)用范圍的擴大，極大增加了毒素污染風(fēng)險和人類中毒的幾率。近年來，柑橘皮渣的回收利用成為柑橘加工和副產(chǎn)品綜合利用的一大重點，特別是作為新型動物飼料應(yīng)用廣泛。此外還有柑橘粉、柑橘酒、柑橘糖漿等副產(chǎn)物的研發(fā)，極大的擴展了柑橘類果皮的使用范圍，而柑橘皮是真菌毒素污染的首要部分，這些產(chǎn)品極大增加了毒素污染柑橘食品和通過污染飼料繼而污染畜禽等動物源性食品的風(fēng)險，間接威脅人類飲食安全。

目前，國內(nèi)外尚無針對柑橘類水果真菌毒素污染的檢測標(biāo)準(zhǔn)及限量標(biāo)準(zhǔn)，難以實現(xiàn)對農(nóng)產(chǎn)品以及工業(yè)化生產(chǎn)的安全監(jiān)控。

總之，在柑橘產(chǎn)業(yè)鏈中真菌毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)和污染控制研究處于空白階段的情況下，需要結(jié)合國內(nèi)外對水果真菌毒素的研究，對柑橘真菌毒素污染分布、快速檢測及其控制技術(shù)進行確定和改良，這也是提高柑橘產(chǎn)品競爭優(yōu)勢的必要條件，研究如何在柑橘制品生產(chǎn)過程中去除污染的真菌毒素以及如何高效快速檢測相關(guān)產(chǎn)品的污染水平將成為研究重點。

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