于淑娟 馬菲 徐獻(xiàn)兵

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

美拉德反應(yīng)(Maillard Reaction)，又稱非酶褐變或羰氨反應(yīng)，是還原糖(碳水化合物)與氨基酸/蛋白質(zhì)在常溫或加熱時發(fā)生的一系列復(fù)雜的反應(yīng)，最終生成棕色甚至黑色的高分子類黑精(或稱擬黑素)［1-6］．美拉德反應(yīng)過程一般可歸納為初始階段、中間階段和高級階段3個階段．在初始階段，酮糖可與氨基化合物生成酮糖基胺，而酮糖基胺可以經(jīng)過海恩氏(Heyns)分子重排異構(gòu)成2-氨基-2-脫氧葡萄糖;此外，含有醛基的還原糖(如葡萄糖)的羰基與氨基酸或蛋白質(zhì)中的自由氨基脫水縮合生成N-葡萄糖基胺，N-葡萄糖基胺經(jīng)Amadori分子重排轉(zhuǎn)變成1-氨基-1-脫氧-2-酮糖．在中間階段，Heyns重排產(chǎn)物2-氨基-2-脫氧葡萄糖發(fā)生重排、脫氨基等反應(yīng)，生成二羰基化合物等中間體，同時Heyns重排產(chǎn)物在高溫下會直接裂解生成丙酮醇、丙酮醛等活性物質(zhì)［7］，其中丙酮醛是一種 1，2-二羰基化合物，是該階段中1，2-烯醇化、2，3-烯醇化和逆羥醛反應(yīng)的重要活性產(chǎn)物［8-9］;Amadori重排產(chǎn)物 1-氨基-1-脫氧-2-酮糖則經(jīng)重排、脫氨、Strecker降解、裂解等反應(yīng)生成醛類、丙酮醛等二羰基化合物類活性中間體［10-13］．在高級階段，眾多活性中間體及雜環(huán)類化合物等經(jīng)過極其復(fù)雜的反應(yīng)生成棕色甚至是黑色的類黑精［10-13］．

隨著人們對美拉德反應(yīng)歷程的深入研究，亞硫酸根對美拉德反應(yīng)褐變的抑制作用已經(jīng)得到證實(shí)［14-16］，但以2-氨基-2-脫氧葡萄糖作為初始美拉德反應(yīng)物研究亞硫酸根對反應(yīng)中間產(chǎn)物及褐變程度的影響卻鮮見報(bào)道．由于葡萄糖多以半縮醛形式存在，亞硫酸根基本不與葡萄糖直接發(fā)生反應(yīng)［14］，文中以美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物2-氨基-2-脫氧葡萄糖為起始反應(yīng)物，同時監(jiān)測美拉德反應(yīng)中重要的中間產(chǎn)物丙酮醛的變化，研究亞硫酸根對2-氨基-2-脫氧葡萄糖及其降解產(chǎn)物的影響．

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 材料與設(shè)備

甲醇，色譜純，德國 Merck公司產(chǎn)品;2-氨基-2-脫氧葡萄糖(氨基葡萄糖)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯二胺(OPD)，分析純，美國Sigma公司產(chǎn)品;乙醇、碳酸鈉、碳酸氫鈉，色譜純，美國Sigma公司產(chǎn)品;亞硫酸鈉，分析純，廣州化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水．

Waters 600高效液相色譜儀、Waters Atlantis T3色譜柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)、Waters 2998 型二極管陣列檢測器，美國Waters公司生產(chǎn);ICS 5000型高效離子色譜儀，美國Dionex公司生產(chǎn);TU-1901型紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用有限責(zé)任公司生產(chǎn);PL403型分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn);電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)．

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 樣品制備

分別加入 0、4、40、400 mmol亞硫酸鈉于 1 L 氨基葡萄糖溶液(40 mmol/L，以pH=7．4的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑)中，并充分混勻，110℃密閉反應(yīng)0．5、1．0、2．0、3．0 和4．0h，冰水浴冷卻至室溫，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

參考 Gobert［13］、Arena 等［17］的方法，利用鄰苯二胺衍生化丙酮醛．準(zhǔn)確稱取0．01 g鄰苯二胺溶于20mL pH=7．4的磷酸緩沖溶液，配制成0．5 g/L的鄰苯二胺衍生試劑．分別取1mL上述反應(yīng)后的樣品溶液與1mL衍生試劑混合均勻后，于37℃靜置12h后進(jìn)行分析測定．

1．2．2 美拉德反應(yīng)樣品的吸光度測定

按照文獻(xiàn)［18］的方法測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度．分別取20μL樣液加入3mL去離子水稀釋，測定420nm下的吸光度．

1．2．3 美拉德反應(yīng)體系中丙酮醛含量的測定

參照Gobert等［13］的方法，通過鄰苯二胺衍生法監(jiān)測丙酮醛含量．衍生化后的樣品過0．45 μm微孔濾膜，以備HPLC分析．選用Waters 600型高效液相色譜儀、Waters 2998型二極管陣列檢測器和Waters Atlantis T3 色譜柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)組成HPLC分析系統(tǒng)，HPLC條件如下:流動相采用水-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，首先用5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的甲醇洗脫5min，然后用5% ～30%甲醇梯度洗脫5min，再用30% ～40%甲醇梯度洗脫35min，最后用100%甲醇洗脫15min;流速設(shè)置為1mL/min;柱溫為25℃;進(jìn)樣量為20μL．

美拉德反應(yīng)體系中丙酮醛衍生物(2-甲基喹喔啉)的保留時間為27．6 min，檢測范圍為0．002～3．200mmol/L．丙酮醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=107c，r2=0．9999，其中:c為丙酮醛濃度，mmol/L;A為2-甲基喹喔啉峰面積．

1．2．4 美拉德反應(yīng)體系中還原糖含量的測定

精確移取100μL樣液，加入5mL去離子水稀釋后過0．45 μm微孔濾膜，以備高效陰離子色譜-電化學(xué)(HPAEC-ED)分析．選用Dionex ICS 5000型離子色譜儀、CarboPac PA1陰離子交換柱(250 mm×4mm)和保護(hù)柱(50 mm×4 mm)組成HPAEC-ED分析系統(tǒng)．色譜條件如下:淋洗液A液為500 mmol/L的NaOH，B液為去離子水;先用濃度為5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的 A液等度洗脫20 min，再用濃度為100%的A液洗脫10 min，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20μL，柱溫為30℃．

美拉德反應(yīng)體系中氨基葡萄糖、葡萄糖、果糖的保留時間分別為 10．97、13．50、18．00 min．氨基葡萄糖、葡萄糖和果糖的線性回歸方程分別如下:

其中，y1、y2、y3分別為氨基葡萄糖、葡萄糖和果糖的峰高，x1、x2、x3分別為氨基葡萄糖、葡萄糖、果糖的濃度．

2 結(jié)果與討論

2．1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物色值的變化

通過測定420nm處的紫外吸光度(A420)來監(jiān)測亞硫酸鈉-氨基葡萄糖反應(yīng)體系的色值［18］．亞硫酸根對氨基葡萄糖-亞硫酸根體系A(chǔ)420的影響如圖1所示．

由圖1可見，反應(yīng)開始后的前0．5h，反應(yīng)體系的A420顯著增加，此后進(jìn)一步延長反應(yīng)時間，A420變化不顯著;同時發(fā)現(xiàn)，增大體系中的亞硫酸根濃度可降低反應(yīng)體系的A420．上述結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時間的延長，美拉德反應(yīng)向高級階段進(jìn)行并形成類黑精，加入亞硫酸根可抑制類黑精的形成．有文獻(xiàn)報(bào)道［19-21］，在美拉德反應(yīng)高級階段，類黑精主要是通過體系中二羰基化合物的羥醛縮合聚合生成的一種高分子化合物．由于亞硫酸根具有很強(qiáng)的親核反應(yīng)能力，很容易與體系中的二羰基化合物發(fā)生親核反應(yīng)，并生成磺酸鹽縮合產(chǎn)物，這種產(chǎn)物可抑制羥醛縮合反應(yīng)的進(jìn)行，從而抑制美拉德反應(yīng)高級階段類黑精的生成．

圖1 氨基葡萄糖-亞硫酸根體系加熱反應(yīng)過程中A420的變化Fig．1 Change of A420in glucosamine-sulfate model system during heating

2．2 美拉德反應(yīng)體系中丙酮醛含量的變化

利用HPLC檢測不同亞硫酸根含量下氨基葡萄糖-亞硫酸根反應(yīng)體系反應(yīng)0．5 h后丙酮醛的含量［9］，反應(yīng)體系的高效液相色譜圖如圖2所示．

圖2 氨基葡萄糖-亞硫酸根體系加熱反應(yīng)0．5h后的高效液相色譜圖Fig．2 High-performance liquid chromatograms of glucosaminesulfate model system after heating 0．5h

由圖2可見，在美拉德反應(yīng)的復(fù)雜產(chǎn)物中，丙酮醛(MGO)是反應(yīng)體系中變化最明顯的中間產(chǎn)物，通過對其進(jìn)行監(jiān)測來研究亞硫酸根對美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的影響具有代表性．

反應(yīng)體系中丙酮醛含量的變化如圖3所示．由圖3可見:當(dāng)亞硫酸根濃度小于4 mmol/L時，反應(yīng)體系中丙酮醛的含量相對較少;反應(yīng)體系中亞硫酸根的濃度增大到40或400 mmol/L時，體系中的丙酮醛含量明顯增加，但隨反應(yīng)時間的延長(大于1h)丙酮醛含量降低．上述結(jié)果表明，亞硫酸根的加入可促進(jìn)美拉德反應(yīng)體系中丙酮醛的生成，延長反應(yīng)時間，丙酮醛發(fā)生降解形成類黑精等高級階段產(chǎn)物．

圖3 氨基葡萄糖-亞硫酸根體系加熱反應(yīng)過程中丙酮醛濃度的變化Fig．3 Change of MGO in glucosamine-sulfate model system during heating

2．3 美拉德反應(yīng)體系中還原糖含量的變化

利用高效離子交換色譜儀監(jiān)測亞硫酸根濃度對氨基葡萄糖-亞硫酸根反應(yīng)體系的影響，結(jié)果如圖4所示．

圖4 氨基葡萄糖-亞硫酸根體系加熱反應(yīng)過程中的高效離子色譜圖Fig．4 High-performance anion exchange chromatograms of glucosamine-sulfate model system during heating

反應(yīng)體系中氨基葡萄糖含量的變化如圖5所示．由圖5可見，在亞硫酸鈉含量不同的反應(yīng)體系中，氨基葡萄糖基本都在反應(yīng)1 h后完全降解，且降解速率無顯著差異，說明亞硫酸根并沒有抑制氨基葡萄糖的降解．

圖5 氨基葡萄糖-亞硫酸根體系加熱反應(yīng)過程中2-氨基-2-脫氧葡萄糖濃度的變化Fig．5 Change of 2-amino-2-deoxyglucose in glucosaminesulfate model system during heating

亞硫酸根濃度對反應(yīng)體系中葡萄糖含量的影響如圖6所示．由圖6可見:當(dāng)反應(yīng)體系中無亞硫酸根時，體系中僅產(chǎn)生少量葡萄糖且迅速降解;當(dāng)反應(yīng)體系中加入少量亞硫酸根(4 mmol/L)時，體系中葡萄糖的含量顯著增加，但此后繼續(xù)增加亞硫酸根含量，葡萄糖含量顯著降低．這一結(jié)果說明，體系中少量硫酸根的存在有利于葡萄糖的生成，過量亞硫酸根可促進(jìn)體系中葡萄糖的消耗．產(chǎn)生上述現(xiàn)象的主要原因是親核試劑亞硫酸根進(jìn)攻氨基葡萄糖中的含氮碳原子，促進(jìn)氨基葡萄糖發(fā)生脫氨反應(yīng)并進(jìn)一步水解產(chǎn)生葡萄糖，當(dāng)體系中加入過量的亞硫酸根時，多余的亞硫酸根會同時與葡萄糖的羰基發(fā)生親核加成反應(yīng)而消耗葡萄糖．

圖6 氨基葡萄糖-亞硫酸根體系加熱反應(yīng)過程中葡萄糖濃度的變化Fig．6 Change of glucose in glucosamine-sulfate model system during heating

亞硫酸根濃度對反應(yīng)體系中果糖含量的影響如圖7所示．由圖7可見:當(dāng)反應(yīng)體系中無亞硫酸根時，僅有少量的果糖產(chǎn)生且很快被消耗完;當(dāng)反應(yīng)體系中加入亞硫酸根時，亞硫酸根對體系中果糖含量的影響規(guī)律與葡萄糖的基本一致．綜合圖6、7可見，加入相同量的亞硫酸根時，果糖的含量明顯多于葡萄糖的含量．據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［11，22］，在堿性環(huán)境中，Heyns分子重排產(chǎn)物可通過逆重排反應(yīng)生成果糖．本實(shí)驗(yàn)中亞硫酸根的加入可促進(jìn)氨基葡萄糖的逆重排反應(yīng)從而生成果糖．產(chǎn)生上述現(xiàn)象的另一種原因是:氨基葡萄糖脫氨生成的葡萄糖在弱堿性條件下發(fā)生異構(gòu)化生成果糖．另外，當(dāng)反應(yīng)體系中加入過量的亞硫酸根時，亞硫酸根可與果糖的羰基發(fā)生親核加成反應(yīng)，從而消耗果糖．

圖7 氨基葡萄糖-亞硫酸根體系加熱反應(yīng)過程中果糖濃度的變化Fig．7 Change of fructose in glucosamine-sulfate model system during heating

2．4 亞硫酸根對美拉德反應(yīng)體系的影響機(jī)理分析

綜合前文的分析，推斷亞硫酸根對美拉德反應(yīng)體系的影響機(jī)理如圖8所示．2-氨基-2-脫氧葡萄糖在pH=7．4環(huán)境下高溫加熱，發(fā)生以下3個路徑的反應(yīng)歷程:

(1)2-氨基-2-脫氧葡萄糖在堿性環(huán)境下發(fā)生逆重排反應(yīng)，經(jīng)1，2烯醇化反應(yīng)得到1，2-烯醇胺，進(jìn)而生成亞胺正離子，經(jīng)可逆反應(yīng)得到席夫堿，最后經(jīng)過化合物1生成果糖，該過程被稱作Heyns逆重排反應(yīng)［11，22］，體系中的亞硫酸根促進(jìn)了 2-氨基-2-脫氧葡萄糖經(jīng)Heyns逆重排反應(yīng)生成果糖，使反應(yīng)體系中的果糖含量增加，另一方面果糖又與亞硫酸根離子親核加成生成化合物2，從而消耗掉體系中的果糖，因此，隨著體系中亞硫酸根含量的增加，體系中果糖逐漸被消耗;

圖8 亞硫酸根存在下2-氨基-2-脫氧葡萄糖的降解機(jī)理推斷Fig．8 The proposed mechanism for the degradation of 2-amino-2-deoxyglucose in the presence of sulfite

(2)2-氨基-2-脫氧葡萄糖的氨基被亞硫酸根取代生成化合物1，進(jìn)而又脫去磺基生成葡萄糖，葡萄糖在弱堿性條件下經(jīng)1，2-烯醇化異構(gòu)生成果糖，同時亞硫酸根與反應(yīng)體系中的葡萄糖經(jīng)親核加成反應(yīng)生成化合物5，使得葡萄糖被消耗;

(3)2-氨基-2-脫氧葡萄糖脫羥基生成化合物6，又重排生成化合物7，經(jīng)脫氨基生成3-脫氧-1，2-二羰基化合物，在pH值大于7的高溫條件下，裂解生成丙酮醛、丙酮醇等中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物進(jìn)一步聚合生成高級產(chǎn)物類黑精［10-13］，但是體系中的亞硫酸根與丙酮醛易通過親核加成反應(yīng)生成化合物8和9，這一過程抑制了丙酮醛直接聚合生成類黑精，從而抑制了體系中色值的上升．

3 結(jié)論

2-氨基-2-脫氧葡萄糖是果糖與銨鹽在美拉德初級反應(yīng)階段產(chǎn)生的一種典型的Heyns重排產(chǎn)物．文中以2-氨基-2-脫氧葡萄糖為初始美拉德反應(yīng)物，分別加入不同量的亞硫酸鈉，在110℃下反應(yīng)不同時間．通過紫外-可見分光光度計(jì)、高效液相色譜儀及高效離子交換色譜儀分析了亞硫酸根對體系褐變程度、丙酮醛含量、2-氨基-2-脫氧葡萄糖含量、葡萄糖含量及果糖含量的影響．得出如下結(jié)論:

(1)亞硫酸根可顯著抑制反應(yīng)體系的褐變、促進(jìn)裂解產(chǎn)物丙酮醛的產(chǎn)生;

(2)亞硫酸根對2-氨基-2-脫氧葡萄糖的降解沒有抑制作用;

(3)體系中少量亞硫酸根的存在有利于葡萄糖的生成，過量亞硫酸根可促進(jìn)體系中葡萄糖的消耗;

(4)亞硫酸根對體系中果糖含量的影響規(guī)律與對葡萄糖的基本一致．

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