張海華，王 鑫，徐麗萍

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱150076)

桔梗屬于大宗藥材品種，形似人參，藥食兩用，素有“南方人參”的美譽.桔梗不僅是一種傳統(tǒng)中藥[1]，還是一種食品，其中含有多種氨基酸，以及鈣、鎂、鐵、鋅、錳、銅、鉛、磷等人體必需微量元素，此外桔梗中還含有大量亞油酸等不飽和脂肪酸、多聚糖、無機鹽、甾體類化合物等[2].桔梗中含有的大量亞油酸等不飽和脂肪酸，具有降壓降脂、抗動脈粥樣硬化等多種作用，由此可見桔梗是一種很好的功能性食品.桔梗的主要活性成分為桔梗皂苷(platycodin，PD)，桔梗中三萜皂苷經(jīng)近幾年來的研究結果表明它在養(yǎng)禽業(yè)上具有重要的作用.三萜皂苷類有精神安定、放松肌肉和降溫的作用.還具有抗癌、抗腫瘤作用，可抑制癌細胞的增長，對消化系統(tǒng)尤其是胃癌效果明顯[3].

桔梗是我國銷量最大的40種傳統(tǒng)中藥材之一.近年來，作為藥食同源的傳統(tǒng)中藥，桔梗在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、祛痰、保肝、降血脂等方面的藥理作用引起了廣泛關注[4].目前，研究較多的單體化合物為桔梗皂苷 A、B、C、D、D2、D3和遠志皂苷 D、D2[5]，韓國學者將桔梗生藥水提后過DiaionHP－20樹脂得到水/丙酮系統(tǒng)不溶的淺黃色粉末狀物質(zhì)，即桔梗菊糖型多聚糖，發(fā)現(xiàn)其也具有豐富的藥理作用[6－7].

1 材料與方法

1.1 實驗材料

桔梗根，市售.

1.2 主要試劑與儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術有限公司);葡聚糖凝膠層析柱G－25(上海君威生物科技有限公司)紫外可見分光光度計TU－1900型(北京普析通用儀器有限責任公司);微型植物粉碎機FZ102機型(天津市泰斯特儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器R－205型(上海申勝生物技術有限公司);電子分析天平ALC－1100.2型(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);電子恒溫水浴箱DK－98－1型(天津市泰斯特儀器有限公司);半自動收集器(北京艾杰爾科技有限公司)無水乙醇(天津市天新精細化工開發(fā)中心);甲醇(哈爾濱新春化工廠);濃硫酸(哈爾濱市新達化工廠);氫氧化鈉(天津市化學試劑三廠);高氯酸(哈爾濱理工化學試劑有限公司);冰醋酸(哈爾濱理工化學試劑有限公司);香草醛(天津市天新精細化工開發(fā)中心);人身皂甙標準品(上海思域化工科技有限公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲波水提法提取桔梗總皂苷

將新鮮桔梗烘干，采用粉碎機粉碎成末，取一定桔梗碎末放入錐形瓶中，加入10倍蒸餾水，超聲振蕩30 min(保持水溫＜60℃，超聲功率50 W)提取桔?？傇碥?對提取液進行過濾，棄去濾渣，收集濾液.沉淀再次加水100 mL，同上處理，再提取1次，合并2次提取液，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進行濃縮.

1.3.2 人參皂苷標準曲線的繪制

1)人參皂苷最大吸收波長的確定

配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的人參皂苷標準品溶液，以蒸餾水作為標準空白，采用1 cm石英比色皿，雙光束紫外分光光度法，在波長為190～400 nm范圍內(nèi)進行掃描，確定人參皂苷最大吸收波長.

2)人參皂苷標準曲線的繪制

分別取不同體積質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的人參皂苷標準溶液，定容至25 mL.分別于最大吸收波長處測其吸光值，以人參皂苷質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，最大吸收波長下的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線.

1.3.3 凝膠層析分離桔梗皂苷單因素的選擇

以桔梗皂甙分離效果為指標，根據(jù)實驗條件和相關文獻確定影響提取效果的因素，如乙醇體積分數(shù)、上樣量、流速.為了確定實驗中各因素對桔梗皂甙分離效果的影響，進行單因素實驗.即改變某一條件，固定其他條件，確定桔梗皂甙的分離效果.

1)乙醇體積分數(shù)單因素實驗

將樣品進行進行預處理后，分別讓其通過凝膠色譜柱進行層析.采用乙醇作為洗脫溶劑，分別選取乙醇體積分數(shù)為60%、65%、70%、75%、80%，凝膠體積與上樣量比為1∶4，流速為1 mL/min，考察乙醇體積分數(shù)對洗脫效果的影響.

2)料液比單因素實驗

將樣品進行進行預處理后，分別讓其通過凝膠色譜柱進行層析.采用凝膠體積與上樣量的比值分別為 1∶2、1∶3、1∶4 、1∶5、1∶6，流速為 1 mL/min，乙醇體積分數(shù)為75%，考察上樣量對洗脫效果的影響.

3)洗脫劑流速單因素實驗

將樣品進行進行預處理后，分別讓其通過凝膠色譜柱進行層析.采用凝膠體積與上樣量的比值分別為1∶4，流速分別為 0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL/min，乙醇體積分數(shù)為75%，考察洗脫劑流速對洗脫效果的影響.

1.3.4 凝膠層析分離桔梗皂苷最佳條件的選擇

根據(jù)單因素實驗的結果，選擇影響洗脫效果的三個主要因素:乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、洗脫劑流速(C)，采用正交設計表L9(34)安排實驗.因素水平表見表1.

表1 正交試驗因素水平表

1.3.5 桔梗皂苷定量分析實驗

分別取純化所得到的50管樣品各2.5 mL，分別加入甲醇溶液2.5 mL，搖勻.水浴揮去溶劑.加入新配制的5%香草醛－冰醋酸0.1 mL，高氯酸0.4 mL.在60℃水浴中加熱15 min，流水冷卻.加冰醋酸2.5 mL，搖勻，放置15 min.在 546 nm 下用722分光光度計測吸光值，甲醇溶液隨行空白對照.分別測出50管樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線計算每管樣品中桔梗皂苷含量.

1.3.6 桔梗皂苷定性分析實驗

1)泡沫實驗

取桔?？傇碥仗崛∫?0 mL于試管中強列振搖，觀察其現(xiàn)象，記錄泡沫持續(xù)時間.

取2支試管，分別加入0.1 mol/L鹽酸液5 mL、0.1 mol/L氫氧化鈉液5 mL，再各加入桔?？傇碥杖芤?，分別調(diào)整pH值為1、13，強烈振搖，觀察.

2)顏色反應實驗

①醋酐－硫酸反應(Liebermann Burchard)

取桔?？傇碥辗勰? g，加1∶20濃硫酸數(shù)滴，觀察其顏色變化.

②三氯醋酸反應(Rosen－Heimer)

將桔?？傇碥杖芤旱卧跒V紙上，噴三氯醋酸試劑，加熱，觀察在不同溫度下其顏色變化.

2 結果與討論

2.1 超聲波水提法提取桔?？傇碥战Y果與分析

用超聲波－水提法提取桔梗總皂苷，并用水飽和正丁醇對桔梗粗皂苷濃縮溶液進行萃取提純，經(jīng)三次平行實驗計算桔?？傇碥仗崛÷?見表2.

表2 超聲波水提法提取桔梗皂苷結果表

超聲波具有空化、粉碎、攏拌等特殊作用，可以破壞植物細胞，使溶劑滲透到植物的細胞中，以使于植物中的化學成分溶于溶劑之中.采用超聲波－水提法提取桔梗總皂苷的提取率比較高，比傳統(tǒng)回流加熱的方法要節(jié)省大量時間，可滿足桔?？傇碥盏目焖偬崛∫?而利用水作為溶劑提取桔?？傇碥毡仁褂靡掖嫉扔袡C溶劑作為溶劑的提取方法，不但能獲得較高的提取量，而且安全性有了提高，同時在保證了桔梗作為藥食兩用性食品原料的開發(fā)可能的同時也節(jié)省了大量的試劑.超聲波－水提法提法提取的桔?？傇碥仗崛÷首罡邽?.25%.

2.2 人參皂苷標準曲線繪制結果與分析

2.2.1 桔梗皂甙最大吸收波長的確定

以人參皂苷Rg1作標樣，利用紫外可見分光光度計對人參皂苷Rg1標樣進行光譜掃描，確定人參皂苷Rg1標樣的最大吸收波長為201 nm，掃描結果見圖1.

圖1 人參皂苷標準品紫外掃描圖譜

2.2.2 皂苷標樣標準曲線的繪制

標準曲線的繪制結果:在546 nm下用722分光光度計測定不同質(zhì)量濃度人參皂苷Rg1標樣的吸光值，擬合得回歸方程:y=37.357x+0.014 9(r2=0.995 5)，繪制標準曲線見圖2.

圖2 皂苷標樣的標準曲線

2.3 凝膠層析分離桔梗皂苷方法的研究

采用凝膠層析方法，選取影響桔梗皂甙分離效果的主要因素:乙醇體積分數(shù)、上樣量、流速，對三個因素分別進行單因素實驗，以分離效果為指標，確定三個因素下對桔梗皂甙提取效果的影響.2.3.1 洗脫劑體積分數(shù)的選擇結果與分析

從圖3中可以看出，通過對乙醇體積分數(shù)60%、65%、70%、75%、80%的變化進行實驗測定，在乙醇體積分數(shù)為75%時，達到最大吸光值.吸光值越大，根據(jù)繪制的標準曲線方程，桔梗皂苷含量也就越高.所以在采用凝膠層析法分離桔梗皂苷時，選擇75%的乙醇體積分數(shù)為最佳分離條件.

圖3 乙醇體積分數(shù)對桔梗皂甙分離效果的影響

2.3.2 上樣量的選擇結果與分析

從圖4中可以看出，通過對凝膠體積與上樣量的體積比1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 分別進行實驗測定，得到在凝膠體積與上樣量的體積比為1∶4時，達到最大吸光值，根據(jù)標準曲線方程，桔梗皂苷含量也就越高.因此在采用凝膠層析法分離桔梗皂苷時，選擇凝膠體積與上樣量的體積比為1∶4為最佳分離條件.

圖4 上樣量對桔梗皂甙分離效果的影響

2.3.3 流速的選擇結果與分析

從圖5中可以看出，采用流速為1 mL/min時，通過對洗脫劑流速的控制，得出在流速為1 mL/min時，桔梗皂甙達到最大吸光值.由此可見，在采用流速為1 mL/min時，洗脫劑用量與上樣量比為1∶1最佳，以免浪費洗脫劑用量，節(jié)省資金.

圖5 洗脫劑流速對桔梗皂甙分離效果的影響

2.4 凝膠層析分離桔梗皂苷最佳條件結果與分析

通過正交實驗確定最佳的分離方法，考察指標為桔梗皂苷最佳吸光值，其實驗結果見表3.

由極差分析可知，影響桔梗皂苷分離因素的主次順序依次為洗脫劑流速(C)、乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B).最佳工藝條件為A2B2C1，即乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶4，洗脫劑流速1.0 mL/min.

表3 正交試驗結果表

2.5 桔?？傇碥斩ㄐ越Y果分析

2.5.1 泡沫試驗結果分析

經(jīng)試驗驗證，桔梗皂苷溶液經(jīng)振搖后產(chǎn)生持久性泡沫15 min以上(即為陽性反應)且兩支試管產(chǎn)生泡沫的高度相同，由此可以證明桔梗皂苷中含有三萜皂苷.

2.5.2 顏色反應試驗結果分析

1)醋酐－硫酸反應(Liebermann Burchard)

醋酐－硫酸反應是檢驗皂苷的常用方法，皂苷與醋酐－濃硫酸反應，產(chǎn)生顏色變化，顯紫色－粉紅色的為三萜皂苷，甾體皂苷顯藍－綠色.

試驗結果顯示桔?？傇碥杖芤旱拇佐蛩岱磻@紫色－粉紅色，由此可以證明其含有三萜類皂苷.

2)三氯醋酸反應(Rosen－Heimer)

皂苷與三氯醋酸試劑反應產(chǎn)生顏色變化，在60℃時能顯紅色－紫色變化的為甾體皂苷，在100℃時才出現(xiàn)紅色－紫色的變化，為三萜皂苷.

試驗結果顯示桔?？傇碥赵?00℃顯示紅色－紫色，由此可以證明其含有三萜類皂苷.

3 結語

本文以桔梗為原料研究了桔?？傇碥占兓淖罴逊蛛x條件.分別采用不同洗脫劑體積分數(shù)、上樣量、流速、洗脫劑用量對桔?？傇碥者M行凝膠層析，以桔梗皂苷純化率為指標確定凝膠層析分離桔梗皂苷最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)70%，凝膠體積與上樣量比為1∶4，流速為1 mL/min，洗脫劑用量與上樣量為1∶1.在經(jīng)過純化的分離條件下進行實驗，桔?？傇碥盏募兓蔬_到了38%.通過定性試驗判定桔?？傇碥蘸腥圃碥?

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[6] KUBO M，NAGAO T，MATSUDA H，et al.Pharmacological Studies on Platycodi Radii(I).Effect on the Phagocytosis in Mouse[J].Shoyakugaku Zasshi，1986，40(4):367.

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