李 力 陸兆豐 沈 凌

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 洛陽 471000

神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法已趨成熟，但體內(nèi)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上更接近體內(nèi)生長的神經(jīng)細(xì)胞。雞胚絨毛尿囊膜層是天然的培養(yǎng)基［1－2］，將孵化13～15d的雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元種植于正在孵化的雞胚的絨毛尿囊膜層，使神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境得到進(jìn)一步改善，從而提高神經(jīng)細(xì)胞生長、分化及再聚集并發(fā)育成正常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織的成功率。

1 材料及方法

1．1 種蛋的選擇及消毒 選擇表面清潔、蛋殼均質(zhì)、蛋形規(guī)范、質(zhì)量50～60g、氣室、氣孔均勻受精雞胚；種蛋用溫水清洗、擦干，于1∶1 000新潔爾滅液中浸泡3min后擦干放入消毒蛋托備用；蛋托采用廢棄的經(jīng)消毒的六孔培養(yǎng)板。

1．2 雞胚培養(yǎng) 種蛋置于（37．8±0．5）℃、相對濕度65%～70%環(huán)境的恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，轉(zhuǎn)蛋2次／d。將孵育13～15d的種蛋作為供體，孵育3～5d的種蛋作為載體。

1．3 雞胚開窗 孵育3～5d時，將雞蛋在超凈臺中先用安爾碘擦拭，再用75%乙醇擦拭消毒。用無菌砂輪在雞胚的氣室極打磨出一個直徑1．5～2．0cm的圓形窗口，用無菌鑷子輕輕揭去蛋殼及附著的部分卵殼膜，暴露卵殼膜的下半部分。用無菌注射器在下半部分卵殼膜與蛋殼交界處（此處的卵殼膜與下面的尿囊膜之間有一小空隙）注射約0．1mL的PBS，使卵殼膜與尿囊膜分離，然后用鑷子從分離處輕輕揭去卵殼膜，暴露雞胚絨毛尿囊膜層。

1．4 雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的制?。?－4］及培養(yǎng)［5］取孵 化13～15d的雞胚，用75%酒精消毒蛋殼，并從氣室端磨開，無菌取出胚胎，放入4℃PBS液中反復(fù)清洗后，固定于無菌解剖板上，迅速剪開腹部皮膚并清除腹腔內(nèi)臟器，在解剖顯微鏡下切除腹部椎板，暴露椎管內(nèi)的脊髓，并小心將脊髓從椎管內(nèi)提出。背根神經(jīng)節(jié)（DRG）呈串珠樣位于脊髓的兩側(cè)。逐個摘除脊髓兩旁的DRG，并盡量剝除神經(jīng)節(jié)表面的筋膜，放入35mm培養(yǎng)皿中，眼科剪將神經(jīng)節(jié)剪至1mm3大小的碎塊后移入4mL 0．25%胰蛋白酶內(nèi)，37℃消化40min，1 000r／min離心5min，吸除胰酶消化液，加入FBS液終止消化。1 000r／min離心5min，吸除FBS液換入常規(guī)培養(yǎng)基，將其制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后，按1×1 000 000／mL用微量加樣器吸取0．1mL的細(xì)胞懸液接種于雞胚絨毛尿囊膜層，然后用無菌的透明膠帶將窗口覆蓋。再將雞胚放入恒溫箱中繼續(xù)孵育。每天通過透明膠帶可直接觀察雞胚的存活情況及移植細(xì)胞的情況并定期行病理檢查。

2 結(jié)果

病理檢查顯示，在載體的雞胚絨毛尿囊膜層培養(yǎng)3～5d時，可觀察到神經(jīng)細(xì)胞存活（如圖1）。在載體的雞胚絨毛尿囊膜層培養(yǎng)6～9d時，可觀察到神經(jīng)細(xì)胞生長（如圖2）。在載體的雞胚絨毛尿囊膜層培養(yǎng)11～13d時，可觀察到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成（圖3、圖4）。

3 討論

體內(nèi)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上更接近體內(nèi)生長的神經(jīng)細(xì)胞。雞胚絨毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane，CAM）法簡單、方便、價格便宜、觀察指標(biāo)明確，是目前國內(nèi)外較常用組織細(xì)胞培養(yǎng)模型，雞胚孵化至第8天時，胚膜和血管網(wǎng)的發(fā)育已趨穩(wěn)定，而機(jī)體免疫系統(tǒng)尚未完全建立，此時對各種異物幾乎不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。受精雞胚是一種干細(xì)胞，只有在適宜的外界環(huán)境中（如溫度、濕度、氧飽和度等），才能發(fā)育成個體，而雞胚外液即雞胚絨毛尿囊膜層（雞蛋清）是一種合適的天然“培養(yǎng)基”，具有以下優(yōu)點(diǎn)［2－4］：（1）指標(biāo)易于觀察；（2）移植物成活率高；（3）取材簡單，接種簡單，條件要求低；（4）移植物生長快，實驗周期短；（5）價格低，經(jīng)濟(jì)實用，可同時進(jìn)行大樣本實驗觀察。作者將摘取的雞胚背根神經(jīng)節(jié)制成單細(xì)胞懸液種植于正在孵化的雞胚絨毛尿囊膜層培養(yǎng)，使神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境得到進(jìn)一步改善，從圖1～4可以看將雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元移植于絨毛尿囊膜層培養(yǎng)，DRGn能在雞胚絨毛尿囊膜層生長、分化及再聚集并發(fā)育成正常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織。為背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的研究和腦、脊髓等神經(jīng)組織損傷后的修復(fù)、功能恢復(fù)和基層醫(yī)院及醫(yī)學(xué)教學(xué)提供一種易于觀察、取材方便、價格低、實驗周期短、經(jīng)濟(jì)實用的干細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)方法［6－7］。

圖1 神經(jīng)細(xì)胞存活

圖2 神經(jīng)細(xì)胞生長

圖3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成

圖4 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成

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