王鈺瑩 羅 清 胡 康 劉 頌 張霓霓 余麗梅*

1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細(xì)胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563003;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，貴州 遵義 563003;3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563003;4.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，貴州 遵義 563003;5.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563003

化學(xué)治療是治療惡性腫瘤的三大治療手段之一，由于腫瘤患者存在個體差異及腫瘤的異質(zhì)性，腫瘤對各種化療藥物存在著明顯的個體差異［1，2］，特別是腫瘤復(fù)發(fā)和經(jīng)過多次化療的患者。因化療前缺乏患者對化療藥物敏感性和耐藥性的直接檢測證據(jù)，在制定化療方案時不可避免地存在著一定的盲目性，選擇藥物不準(zhǔn)確。多數(shù)化療藥物本身的不良反應(yīng)可造成對機體的損害，更重要的是可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性，貽誤治療時機，增加醫(yī)療成本和患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因而在治療前篩選敏感藥物，選擇高效、有效藥物，進行有的放矢的治療早已成為研究者和臨床醫(yī)生關(guān)注的重要問題。

體外抗腫瘤藥物敏感試驗的方法及結(jié)果準(zhǔn)確與否是影響病人治療方案制訂的關(guān)鍵因素。本室對121例開展了ATP－生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性的檢測，現(xiàn)將檢測情況總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 腫瘤標(biāo)本 收集2011年9月至2012年12月我院121例腫瘤患者的標(biāo)本進行ATP－生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性檢測。其中乳腺癌89例，卵巢癌16例，子宮內(nèi)膜癌4例，宮頸癌4例，口底鱗癌4例，肺癌3例，非霍奇金淋巴瘤1例。121例患者，年齡在29～76歲。

1.2 化療藥物化療藥物為100%藥物血漿峰值濃度(100%PPC)(見表1)。聯(lián)合用藥的每個藥物的濃度與單藥濃度相同。

表1 化療藥物及劑量

*因CTX和IFO在體外無活性，實驗中所采用的是CTX的體內(nèi)活化物苯丁酸氮芥CLB替代。

1.3 儀器和試劑 BHP9504型微孔板發(fā)光分析儀(北京濱松光子技術(shù)股份有限公司)。ATP生物熒光腫瘤藥物敏感性檢測試劑盒，含混合消化酶、培養(yǎng)基、紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)、ATP提取液和熒光酶－熒光素工作液(北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。

1.4 體外藥敏檢測實驗

1.4.1 實體瘤標(biāo)本制備 無菌取得實體瘤手術(shù)標(biāo)本，在含抗生素的培養(yǎng)基中浸泡25min后，剪成0.5～1mm3碎塊，置于50 ml離心管中，加用培養(yǎng)基稀釋1倍的混合消化酶10ml，于37℃消化2～4h，用培養(yǎng)基洗滌2次，獲得單細(xì)胞懸液。臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活的腫瘤細(xì)胞。

1.4.2 漿膜腔積液標(biāo)本的制備 將肝素抗凝的漿膜腔積液標(biāo)本，400g離心10min，去上清，如有大量紅細(xì)胞(＞25%)，加入預(yù)冷的10ml紅細(xì)胞裂解液，冰浴5～10min紅細(xì)胞去除紅細(xì)胞，再加入20ml RPMI 1640培養(yǎng)液，400g離心10分鐘，去上清，加入3～5ml培養(yǎng)基混勻制備得細(xì)胞懸液。臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活的腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度于2～4×106個/ml備用。

1.4.3 加待測藥物于96孔培養(yǎng)板，每個藥物設(shè)100%、50%、25%、12.5%和6.25%PPC 5個濃度，每個濃度2個平行孔，并設(shè)無藥對照組(M0)，和最大抑制對照組(MI)。接種所得腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)為2×104個/孔。在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)5d后，開始測定。最大抑制對照孔加50μl最大抑制劑，其余各孔加50μlATP提取液，在震蕩器上震蕩30s，室溫靜置5min。再次震蕩混勻。每孔取50μl液體，按相應(yīng)的位置加到熒光測試板內(nèi)，每孔加入50μl熒光素－熒光酶混合液。再次震蕩混勻5s，立刻在微孔板發(fā)光分析儀上測定熒光強度。

1.5 藥敏檢測判定標(biāo)準(zhǔn) 計算藥物IC90和IC50。IC90＜90%且IC50＜25%判定為高度敏感;IC90＜90%或IC50＜25%判定為中度敏感;IC90＞90%且IC50＞25%判定為不敏感。

1.6 吉姆薩染色檢測漿膜腔積液中脫落細(xì)胞 收集的漿膜腔積液標(biāo)本離心后制備的細(xì)胞懸液，取0.4ml，按常規(guī)方法進行制片及染色。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本的可評價率 收集的121例標(biāo)本中，原發(fā)灶手術(shù)標(biāo)本61例，組織穿刺標(biāo)本47例，漿膜腔積液標(biāo)本10例，淋巴結(jié)組織標(biāo)本3例，有117例進行了成功的體外藥敏檢測，可評價率為96.69%。4例不成功的標(biāo)本中均來自乳腺癌患者的穿刺組織，標(biāo)本由空心針進行組織穿刺所得，體積較小，獲得的細(xì)胞數(shù)太少而放棄檢測。

2.2 檢測方法可行性 實體瘤手術(shù)后瘤組織標(biāo)本及穿刺活組織標(biāo)本經(jīng)過消化分離出腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種培養(yǎng)5～7天后對細(xì)胞形態(tài)進行觀察，可見藥物組比M0對照組細(xì)胞數(shù)量明顯減少(見圖1)。收集的漿膜腔積液標(biāo)本經(jīng)離心，收集0.5ml細(xì)胞懸液，按脫落細(xì)胞學(xué)方法進行常規(guī)吉姆薩染色，可觀察到轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞(見圖2)，說明不論實體瘤組織標(biāo)本還是漿膜腔積液標(biāo)本，用ATP－生物熒光法均能分離得到腫瘤細(xì)胞，且藥物組與M0對照組比較存活的細(xì)胞明顯減少，由此證明該方法用于體外抗腫瘤藥物敏感試驗是可行的。

圖1 體外抗腫瘤藥敏檢測細(xì)胞形態(tài)(×200)

圖2 腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢測

2.3 藥物敏感性個體差異性 有效的117例患者選用的均是4～8個方案，其中有單藥和聯(lián)合用藥，針對不同的癌標(biāo)本類型，其敏感藥物不同;同一腫瘤類型的患者的標(biāo)本，其敏感藥物也不同。部分患者按常規(guī)方案無效，但按檢測結(jié)果選擇敏感方案后癥狀得以明顯緩解(見圖3)，可見腫瘤患者標(biāo)本的藥物敏感性存在個體差異。

圖3 ATP－生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性檢測結(jié)果圖示

2.4 與臨床治療效果的吻合度調(diào)查 對檢測的117例樣本的病人資料進行查閱、追蹤和統(tǒng)計，因部分病人死亡或僅作一次化療患者資料不能進入統(tǒng)計外，可統(tǒng)計患者數(shù)量為66例。在該檢測項目指導(dǎo)下用藥后:乳腺癌，17.5%的患者新輔助化療后腫塊明顯縮小，77.2%的患者狀況平穩(wěn)，5.3%的患者病情出現(xiàn)進行性惡化;卵巢癌，50%的患者CA125明顯降低，37.5%的患者狀況平穩(wěn)，12.5%的患者病情出現(xiàn)進行性惡化。由以上數(shù)據(jù)可見，該項目在臨床中的陽性有效率較高，達(dá)87.5%以上，與臨床醫(yī)生反饋信息吻合度較高。

3 討論

化學(xué)治療是治療惡性腫瘤的常規(guī)有效手段之一。然而，由于腫瘤對化療藥物的敏感性存在個體差異，以及腫瘤細(xì)胞具有多重抗藥性，導(dǎo)致相同藥對同一類型患者的治療效果不同。如果在用藥前缺乏該癌癥患者對化療藥物敏感性和耐藥性的直接實驗依據(jù)，在化療方案的制定上就會存在一定的盲目性，而不敏感藥物的治療及化療藥物對機體的損傷及其降低機體免疫功能等可導(dǎo)致化療失敗，甚至危及生命。

ATP－生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)(ATP－tumor chemosensitivity assay，ATP－TCA)是目前較為先進的體外藥敏檢測技術(shù)，其原理是在有氧和ATP的條件下，熒光酶催化熒光素發(fā)出熒光，反應(yīng)中所釋放的熒光強度與ATP含量呈正相關(guān)。ATP是細(xì)胞內(nèi)能量的基本來源，細(xì)胞死亡后，胞內(nèi)的ATP被迅速水解而活細(xì)胞中ATP含量基本恒定，因此所測得的熒光強度可以反映活細(xì)胞數(shù)。從而可根據(jù)其判斷抗腫瘤藥物的藥敏結(jié)果。腫瘤細(xì)胞存活率越低，說明腫瘤細(xì)胞對該化療藥物敏感性越高，殺傷力也越強，反之則敏感性越低。

由本室的檢測結(jié)果可見，該方法能有效地從組織、胸腹水、淋巴結(jié)中分離出腫瘤細(xì)胞并進行接種培養(yǎng)，培養(yǎng)一定的時間后，藥物組較M0無藥對照組細(xì)胞數(shù)明顯減少，與藥敏檢測結(jié)果一致。說明用該方法進行體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的藥敏檢測是可行的。細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化與藥物敏感檢測結(jié)果一致，可見該檢測方法的準(zhǔn)確性較高。近年來，國內(nèi)外多家研究機構(gòu)也已應(yīng)用該方法，檢測了多種惡性腫瘤對化療藥物的敏感性，并且已在世界多個國家對該方法進行了多中心的臨床研究，證實其有較高的臨床符合率，抗腫瘤藥物敏感性試驗的檢測及藥物敏感方案的制定在多種腫瘤治療中取得了明顯的效果。德國科隆大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Kurbacher等［1，2］，于 1998 年和 2003 年分別報道了 ATP －TCA指導(dǎo)化療與傳統(tǒng)化療比較和ATP－TCA輔助化療對卵巢癌和乳腺癌治療臨床Ⅱ期試驗，結(jié)果表明ATP－TCA指導(dǎo)化療能夠顯著提高臨床療效，延長病人生存期，與傳統(tǒng)化療模式比較差異極為顯著。日本進行的臨床研究也表明ATP－TCA指導(dǎo)化療顯著提高了胃腸道腫瘤的治療效果，延長了病人的生存期［3］。國外在乳腺癌、肺癌等腫瘤上進行的應(yīng)用ATP－TCA法體外藥敏結(jié)果和體內(nèi)有效率的對比研究表明，體內(nèi)外的結(jié)果比較一致［4－6］。本室所做的檢測結(jié)果經(jīng)查閱病案后也證實，其與臨床治療方案的符合率較高，所得到的各種單藥和聯(lián)合用藥的體外藥物敏感性與臨床上觀察的有效率基本一致，部分患者經(jīng)常規(guī)治療失敗后按藥敏方案進行治療能有效控制病情。這些結(jié)果均提示，ATP－TCA法可以用于腫瘤的體外藥敏檢測。

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