李文君 周正新

1.安徽省六安市中醫(yī)院，安徽 六安 237006;2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

激素性股骨頭缺血性壞死 (Steriod－induced avascular necrosis of femoral head簡稱SANFH)是指因為大劑量應用激素而造成股骨頭骨的活成份 (骨細胞、骨髓造血細胞和脂肪細胞)死亡所引起的病理過程。中醫(yī)藥療法在早期防治激素性股骨頭缺血性壞死方面具有一定的優(yōu)勢。本研究通過實驗探討中藥骨蝕寧Ⅰ號膠囊對實驗SANFH兔TGF－β1表達的影響，為骨蝕寧Ⅰ號膠囊在臨床上進一步推廣應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康8月齡的SPF級長耳新西蘭大白兔40只，體重 (2.0±0.5)㎏，雌雄兼?zhèn)?，雌?1只，雄性19只，均由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供。實驗前常規(guī)適應性喂養(yǎng)2周。按隨機數(shù)字表法分為正常組 (n=4)、骨蝕寧膠囊組 (n=12)、模型組 (n=12)和仙靈骨葆對照組 (n=12)。實驗中對動物的處置均符合中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[1]。實驗地點為安徽醫(yī)科大學動物實驗中心及安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院病理科。

1.2 建立SANFH動物模型 采用安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供健康8月齡長耳新西蘭大白兔40只，體重 (2.0±0.5)kg/只，雌雄兼用，SPF級。實驗動物自由攝食、飲水，室溫控制在22～25℃。隨機選取4只為正常組，余36只用于造模;每間隔24h于兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素，每次50μg/kg，共注射2次，并于第二次注射內(nèi)毒素24h后肌肉內(nèi)注射甲基強的松龍20mg/(kg·d)，連續(xù)注射3d，每次間隔24h。所有實驗動物每周臀部注射青霉素20萬U，預防感染。制備成典型的骨壞死動物模型。

1.3 給藥方法 造模后將各組置于同等條件下喂養(yǎng)，根據(jù)實驗動物用藥換算公式 (Db=Da*Rb/Ra*(Wa/Wb)1/3(其中Db為兔子公斤體重劑量，Da為成人公斤體重劑量，Rb、Ra為體型系數(shù)，分別等于0.093、0.1，Wb、Wa為已知動物體重，兔子體重按照平均體重2kg計算，成人體重按照標準體重60kg計算，即Db=0.47g)計算給藥量，按以上公式分別計算出，骨蝕寧組1.41g/kg·d(按體表面積計算，相當于成人服骨蝕寧Ⅰ號方每天用量10g的3倍);對照組藥用仙靈骨葆按1.92g/kg·d(相當于成人每天總量的13.5g/d的3倍)灌服。各用藥組將藥物用蒸餾水配成藥液15ml灌胃，模型組用生理鹽水15ml灌胃，每日灌胃一次。

1.4 標本采集 各組實驗動物分別于第8周取出股骨頭，取股骨頭前禁食、水12小時。耳緣靜脈注射空氣處死動物，取出右側(cè)股骨頭，將全部股骨頭負重區(qū)沿冠狀面剖開，軟骨下區(qū)切取1.0 mm×1.5 mm×1.0mm組織，進行觀察和檢測。

1.5 檢測指標和方法 標本常規(guī)HE染色，TGF－β1采用免疫組化分析法進行檢測，石蠟切片 (Leica RM2135，厚度4微米)置入10%中性甲醛中固定，取EDTA200g，加入1000ml雙蒸水，攪拌，制成脫鈣液，保持恒溫25～28℃，浸泡約3～4周，每隔3天更換脫鈣液，以針順利刺入骨頭無阻力為脫鈣終點，然后逐級酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后進行連續(xù)切片，TGF－β1免疫組化染色封片后，在熒光顯微鏡10×40倍的鏡下進行觀察，在最大清晰度、最小灰度、最低的失真度下對陽性表達最明顯之處進行數(shù)碼攝片，每張標本片分別攝片三次，把攝得的照片輸入電腦，用捷達DP－801分析系統(tǒng)軟件進行TGF－β1的平均光密度進行分析得到數(shù)據(jù)，把同一張標本片的三張照片所分析得到的數(shù)值進行求平均值即為該標本的一個原始數(shù)據(jù)，把得到的所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

第8周模型組家兔與同期對照組、骨蝕寧組TGF－β1表達比較，有統(tǒng)計學差異 (P＜0.05)。(見下表1)

表1 不同組間TGF－β1免疫組化平均光密度統(tǒng)計分析 (±s，n=12)

表1 不同組間TGF－β1免疫組化平均光密度統(tǒng)計分析 (±s，n=12)

注:與對照比較，*P＜0.05;與骨蝕寧組比較#P＜0.05。

組別 第8周0.4719±0.01007對照組 0.5034±0.01600骨蝕寧組 0.5640±0.00743模型組 0.2344±0.14 168*#正常組

3 討論

骨蝕寧膠囊是安徽中醫(yī)院大學丁鍔教授在長期治療SANFH的臨床實踐中，遵循《黃帝內(nèi)經(jīng)》:“結(jié)者散之，留者攻之”的理念，推廣“活血、祛瘀、生新”的治療原則，提出了以活血化瘀、補腎壯骨的基本治則[2]。丁教授認為股骨頭的生理、解剖特點和股骨頭壞死的病機特點，決定了其所形成的“瘀血”并不同于一般的病癥，常規(guī)活血化瘀藥物難以直達病所，只有配合蟲類藥物才能剔刮深達筋骨之瘀血與痰濁。在此基礎上，再結(jié)合臨床治療脫疽有效藥物的實踐，研制骨蝕寧Ⅰ號方，由穿山甲20g、當歸30g、川芎20g、蜈蚣20g、全蝎20g、土鱉蟲25g、地龍30g、水蛭30g、肉桂10g、姜黃30g、冰片6g組成，共收破瘀通絡之功。

TGF－β是一組具有多功能性蛋白多肽，對多種結(jié)締組織具有復雜生物效應的生長因子，其主要來源于淋巴細胞、血小板、巨噬細胞等。尤以在血小板和骨組織含量最為豐富，TGF－β的生物學作用非常廣泛，可以促進各類軟組織損傷修復、促進血管生長[3－4];參與體內(nèi)許多炎癥反應及組織修復;并參與骨與軟骨的形成。有研究表明TGF－β1在軟骨形成過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[5]。TGF－β在骨修復中所表現(xiàn)的作用體現(xiàn)為對破骨細胞、成骨細胞、軟骨細胞的代謝調(diào)節(jié)。TGF－β對細胞代謝調(diào)節(jié)的作用表現(xiàn)為雙向效應，其既能刺激細胞增殖分化，也能對其抑制。如果周圍環(huán)境比如細胞群分化狀態(tài)及生長條件不同，則TGF－β對細胞群的作用就顯著不同，但一般來說，低濃度TGF－β起刺激作用，高濃度時起抑制作用。對成骨細胞代謝調(diào)節(jié)則表現(xiàn)為促進合成Ⅰ型膠原、骨橋蛋白和骨粘連素。此外，TGF－β還可能通過下列2種途徑從而促進細胞外基質(zhì)合成:①刺激成纖維細胞和成骨細胞中蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生(譬如纖維蛋白溶酶原活化劑的抑制劑);②抑制成骨細胞中蛋白酶的產(chǎn)生以及抑制成纖維細胞中琉基酶和金屬蛋白的產(chǎn)生?；趯毎饣|(zhì)合成的有明顯促進作用，認為TGF－β在創(chuàng)傷愈合、新骨形成、骨組織的修復及重建過程中起重要作用。

短期內(nèi)大劑量應用激素造成股骨頭區(qū)血液供應中斷，局部出現(xiàn)缺血，致使骨的活性成份壞死。有研究表明，在股骨頭壞死的不同階段，組織勻漿TGF－β的表達情況不同，且隨著病情的增加，TGF－β的表達量逐漸減少[6]。骨缺血壞死后隨著機體對壞死區(qū)修復的激活，修復細胞產(chǎn)生TGF－β1的量逐漸增多。本研究顯示給予激素性股骨頭缺血壞死實驗兔骨蝕寧治療后，股骨頭局部TGF－β1的表達上調(diào);模型組TGF－β1的表達顯著降低，表達趨勢恰好相反。表明骨蝕寧膠囊可以促進激素性股骨頭缺血壞死模型兔股骨頭局部TGF－β1的表達。組間比較，有統(tǒng)計學差異，骨蝕寧組作用顯著。表明骨蝕寧膠囊可促進激素性股骨頭缺血壞死模兔股骨頭局部TGF－β1的表達，從而促進壞死股骨頭的修復。

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