劉 敏

貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004

藿香正氣水是由蒼術(shù)、陳皮、厚樸 (姜制)、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、廣藿香油、紫蘇葉油等十味組成，具有解表化濕，理氣和中的功效。用于外感風寒、內(nèi)傷濕滯或夏傷暑濕所致的感冒，證見頭痛昏重、胸膈痞悶、脘腹脹痛、嘔吐泄瀉。在藥品檢驗中，為保證微生物限度檢查方法的科學性及準確性，根據(jù)《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查方法的驗證，以保證所采用的檢驗方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)的測定和控制菌檢查。按照《中國藥典》2010年版的規(guī)定對3批藿香正氣水微生物限度檢查法的試驗進行研究，結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液、MUG培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基。

1.2 供試品 藿香正氣水 (批號:20110601、20110602、20110603)。

1.3 菌種 大腸埃希菌〔CMCC(B)44102〕、金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕、枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕、白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕、黑曲霉〔CMCC(F)98003〕，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 將上述5株菌的新鮮培養(yǎng)物分別接種至規(guī)定培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng)2天，酵母菌培養(yǎng)24h，霉菌培養(yǎng)5天，制備成菌 (孢子)懸液，備用。

2.2 供試液制備 按規(guī)定量取供試品10ml，置無菌錐形瓶中，加入pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100ml，充分振蕩使供試品分散均勻，即為1∶10供試液，備用。

2.3 細菌計數(shù)、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.3.1 試驗組 取供試液 (1∶10)1ml過濾，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗量為100ml，沖洗三次，在最后一次沖洗液中加入50～100cfu各試驗菌，過濾，將濾膜取出，菌面朝上，分別貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，每株試驗品平行制備2個平皿按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法進行培養(yǎng)、計數(shù)。

2.3.2 菌液組 取菌液50～100cfu過濾，將濾膜取出，菌面朝上，分別貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，每株試驗菌平行制備2個平皿，按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法進行培養(yǎng)、計數(shù)。

2.3.3 供試品對照組 取供試液 (1∶10)1ml過濾，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗量為100ml，沖洗三次，過濾，將濾膜取出，菌面朝上，分別貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，每株試驗品平行制備2個平皿按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法進行培養(yǎng)、計數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對照組 用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液1ml代替供試液，其它方法同試驗組操作、培養(yǎng)，計數(shù)，即得。

2.5 回收率 回收率%=(試驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%。

2.6 結(jié)果判斷 在3次平行試驗中，試驗組的菌回收率均應(yīng)在70%以上，該驗證方法可用于試驗;若低于70%，應(yīng)采用適宜的方法消除供試品的抑菌活性，重新進行驗證試驗。

2.7 預(yù)試驗 取1∶10供試液1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1ml/皿分別注1皿為一組，每組加入1種試驗菌菌液，共5組。大腸埃希菌白色念珠菌1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1ml/皿的回收率分別為0、2、16、21、35%，金黃色葡萄球菌1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1ml/皿的回收率分別為 3、5、10、12、20%，枯草芽孢桿菌的回收率分別為0、3、15、23、27%，白色念珠菌的回收率分別為13、10、19、29、34%，黑曲霉的回收率分別為4、11、16、22、35%，根據(jù)以上預(yù)試驗結(jié)果來看，回收率低于70%，證明該品種具有較強的抑菌活性能力，應(yīng)重新采用適宜的方法除菌處理后，進行驗證。根據(jù)上述結(jié)果來看，該品種驗證方法推向薄膜過濾法試驗，試驗結(jié)果見表1。

表1 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證

2.8 控制菌檢查法的驗證

2.8.1 大腸埃希菌檢查 試驗組取1∶10供試液10ml過濾，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗量為100ml，沖洗二次，過濾，將濾膜取放入裝有100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，再加入10～100cfu大腸埃希菌，搖勻，按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法進行培養(yǎng)、觀察，即得。陰性菌對照組方法同試驗組，以金黃色葡萄球菌作為陰性對照菌。供試品1∶10供試液10ml過濾，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗量為100ml，沖洗三次，過濾，將濾膜取放入裝有100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，搖勻，按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法進行培養(yǎng)、觀察，即得。

2.8.2 結(jié)果判斷 陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌;試驗組應(yīng)檢出試驗菌，該試驗方法成立。

2.8.3 控制菌檢查方法驗證 大腸埃希菌采用培養(yǎng)基稀釋法驗證，試驗組檢出試驗菌，陰性菌對照組未檢出陰性菌對照菌。

2.9 結(jié)果 采用經(jīng)驗證的方法檢查3批藿香正氣水，細菌數(shù)均小于10cfu/g，霉菌及酵母菌均小于10cfu/g，未檢出大腸埃希菌。

3 討論

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，采用常規(guī)法 1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1ml/皿供試液量進行大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的計數(shù)驗證，3個批號試驗組的數(shù)據(jù)中，均出現(xiàn)個別平皿回收菌數(shù)與同組數(shù)據(jù)相差太大，甚至有0回收的現(xiàn)象;將供試液的量制備成1∶20供試液0.5ml/皿、0.2ml/皿以降低供試液的抑菌活性，上述現(xiàn)象未能完全消除;最終將細菌檢查采用1∶10供試液薄膜過濾法，該方法對細菌、霉菌及酵母菌進行計數(shù)驗證，同組之間各皿數(shù)值趨于一致。

藿香正氣水處方中的部分原輔料及乙醇具有較強的抑菌活性成分。供試品為口服劑，檢驗取樣時難以保證同一試驗組各個平皿中絕對均勻，對試驗菌的回收造成直接的影響。一般情況下，驗證試驗方法的選擇——預(yù)試驗，可以在較小工作量的前提下，為正式試驗提供一個合理、可行的試驗方法。但藿香正氣水的金黃色葡萄球菌預(yù)試驗，對同一試驗組中可能出現(xiàn)個別平皿回收菌數(shù)大大低于同組其它平皿回收菌數(shù)的異?，F(xiàn)象是不能估計與預(yù)計的。

經(jīng)驗證確認，生產(chǎn)企業(yè)在原輔料、生產(chǎn)工藝、檢驗及處方等條件不變的情況下，藿香正氣水的微生物限度檢查可按以下方法進行檢驗。細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證計數(shù)采用1∶10供試液1ml薄膜過濾法，沖洗總量為300ml;控制菌大腸埃希菌采用1∶10供試液10ml薄膜過濾法，沖洗總量為200ml驗證，其它按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 (一部) [M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄.