馮廣達(dá)，陳美標(biāo)，羊宋貞，朱紅惠

(廣東省微生物研究所/廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，許多非培養(yǎng)法在微生物學(xué)領(lǐng)域的研究中得到廣泛應(yīng)用［1-4］.盡管如此，傳統(tǒng)的平板分離及鑒定工作仍然是獲取微生物資源最直接的方式，發(fā)揮著不可替代的作用.菌株遺傳信息的獲取對于明確其分類地位必不可少，因此需要提取DNA 進(jìn)行基因擴(kuò)增和測序.采用CTAB法［5］、SDS 法［6］或基因組提取試劑盒提取DNA 均具有較好的效果，但在菌株數(shù)量較多的情況下，這些方法仍存在耗時(shí)長或費(fèi)用高等問題.此外，CTAB 法和SDS 法提取DNA 的過程中還會(huì)產(chǎn)生酚、氯仿等有機(jī)污染物.針對該問題，本研究以不同屬的革蘭陰性菌和陽性菌為研究對象，比較了4 種簡單提取細(xì)菌DNA 方法的效果，為其在細(xì)菌資源發(fā)掘和鑒定中的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

革蘭陰性菌7 株，包括:Escherichia coli ATCC 8739、Acinetobacter sp.1PNM-1、Massilia sp.1PNM-3、Sphingomonas sp.1PNM-9、Herbaspirillum sp.9PNM-13、Ralstonia sp.6HR-14 和Moraxella sp.1NM-7.革蘭陽性菌8 株，包括:Bacillus subtilis ATCC 6633、Staphylococcus aureus ATCC 6538、Deinococcus sp.1PNM-7、Arthrobacter sp.9PNM-1、Curtobacterium sp.6PNM-17、Staphylococcus sp.1NM-17、Streptomyces sp.6PNM-9 和Kocuria sp.1PNM-16.其中，Escherichia coli ATCC 8739、Bacillus subtilis ATCC 6633 和Staphylococcus aureus ATCC 6538 由廣東省微生物菌種保藏中心提供，其余菌株均分離自礦區(qū).

1.2 試劑及儀器

酵母提取物和蛋白胨(Oxoid，UK)，酸水解干酪素、瓊脂糖和十二烷基肌氨酸鈉(Sigma，USA)，丙酮酸鈉(國藥集團(tuán)，上海)，EasyTaqTMDNA 聚合酶(全式金，北京)，dNTP 和Maker DL5000(東盛生物，廣州)，引物合成(英駿，上海);PCR 儀(Biometra Tprofessional，Germany)，離心機(jī)(Sigma，USA)，電泳儀(六一，北京).

1.3 DNA 提取

將供試菌株分別接種于R2A［7］液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后期或穩(wěn)定期，菌液渾濁.每個(gè)菌株分別取2 mL 菌液于4 個(gè)離心管中，12 000 r/min 離心2 min，棄上清液.收集的菌體分別按下述4 種方法進(jìn)行處理.

1.3.1 凍融法 向離心管中加入500 μL 的無菌雙蒸水，采用液氮將離心管冷凍后，置于99℃水浴5 min，取出后渦旋30 s，重復(fù)上述操作1 次.12 000 r/min離心，以上清液作為模板.

1.3.2 煮沸法［8］向離心管中加入500 μL 無菌雙蒸水，渦旋30 s，置95℃水浴5 min，12 000 r/min 離心2 min.以上清液作為模板.

1.3.3 堿解法［9］加入50 μL 0.5 mol/L NaOH 溶液于離心管中，渦旋30 s.取5 μL 液體用無菌的0.1 mol/L Tris (pH 8.0)溶液稀釋100 倍，以稀釋液作為模板.

1.3.4 ROSE 法［10］向離心管中加入200 μL ROSE Buffer［10 mmol/L Tris (pH8.0)，312.5 mmol/L EDTA(pH 8.0)，10 g/L 十二烷基肌氨酸鈉，10 g/L 聚乙烯聚吡咯烷酮］，渦旋30 s，置90℃水浴20 min 后，冰浴5 min，取10 μL 液體用無菌雙蒸水稀釋100 倍，以稀釋液作為模板.

1.4 PCR 擴(kuò)增

采用細(xì)菌 16S rRNA 基因引物 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGACTTAACCCCAATCGC-3')［11］對15 株細(xì)菌分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增.25 μL 反應(yīng)體系包括:10× Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L 引物各0.5 μL，Taq 酶1.25 U，模板2 μL，ddH2O 定容至25 μL.PCR 擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3 min;進(jìn)入PCR 循環(huán)，94℃30 s，56℃30 s，72℃1.5 min，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸20 min.PCR 產(chǎn)物采用添加了Goldview 的10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳圖譜來判斷4 種細(xì)菌DNA 提取方法的效果.對其中提取效果較好的方法，增加DNA 提取及PCR 擴(kuò)增的重復(fù)試驗(yàn)2 次，以驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌DNA 提取效果比較

分別采用4 種方法提取了15 株細(xì)菌的總DNA，以之為模板進(jìn)行了16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增.電泳結(jié)果如圖1 所示，以凍融法、煮沸法和堿解法提取的不同屬的革蘭陰性菌的總DNA 為模板，均能夠成功用于16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增，目的片段大小約為1.5 kb，而采用ROSE 法提取的7 株革蘭陰性菌的總DNA 中，僅Escherichia、Acinetobacter、Massilia 和Moraxella 4 個(gè)屬的菌株得到了較好的PCR 擴(kuò)增效果，而其他3 個(gè)屬的菌株P(guān)CR 擴(kuò)增效果較差或失敗.4 種方法對革蘭陽性菌總DNA 的提取效果也存在較大的差異，采用凍融法成功提取了7 株不同屬的革蘭陽性菌菌株的總DNA，僅Staphylococcus aureus ATCC 6538 的總DNA 未能成功提取.采用煮沸法則成功提取了5 株革蘭陽性菌的總DNA，但提取的Staphylococcus aureus ATCC 6538、Deinococcus sp.1PNM-7 和Streptomyces sp.6PNM-9 的PCR 效果較差或失敗.采用堿解法和ROSE 法僅能成功提取4 株革蘭陽性菌的總DNA，而對Deinococcus sp.1PNM-7、Arthrobacter sp.9PNM-1、Streptomyces sp.6PNM-9 和Kocuria sp.1PNM-16 的提取效果較差或失敗.增加凍融法和煮沸法的2 次重復(fù)試驗(yàn)分別取得了與圖1a和圖1b 相同的效果，證明這2 種方法均具有較好的穩(wěn)定性.

圖1 不同DNA 提取方法的PCR 擴(kuò)增效果Fig.1 PCR amplification of bacteria DNA extracted by different methods

凍融法和煮沸法提取DNA 原理均為物理作用裂解細(xì)胞，兩者對Staphylococcus aureus ATCC 6538的總DNA 提取均未成功，但前者對Deinococcus 和Streptomyces 屬菌株的總DNA 提取效果均優(yōu)于煮沸法.堿解法和ROSE 法均為化學(xué)作用裂解細(xì)胞，在革蘭陰性菌的總DNA 提取效果上堿解法優(yōu)于ROSE法，與凍融法和煮沸法取得了相似的效果，但在革蘭陽性菌的DNA 提取上，兩者效果均較凍融法和煮沸法差.堿解法和ROSE 法均能夠成功提取Staphylococcus aureus ATCC 6538 的總DNA，而該菌株采用物理裂解的方法均未成功，這說明化學(xué)作用在裂解革蘭陽性菌的細(xì)胞方面具有一定的優(yōu)勢，但它們對Deinococcus、Arthrobacter、Streptomyces 和Kocuria 屬的菌株DNA 提取均未成功.總體而言，對細(xì)菌總DNA的提取效果排序依次為凍融法、煮沸法、堿解法、ROSE 法，凍融法效果最好.

2.2 細(xì)菌DNA 提取操作規(guī)程

本研究表明了凍融法的DNA 提取效果要優(yōu)于煮沸法，但并不能成功提取所有菌株的總DNA，尤其是革蘭陽性菌.針對該問題，我們提出了如圖2 所示的操作規(guī)程.先對大量分離的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，待對數(shù)期取部分菌液用于甘油種制備.剩余的菌液按照凍融法進(jìn)行前處理，以獲得的上清液為模板進(jìn)行16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增.對于少數(shù)擴(kuò)增效果差或失敗的菌株，則棄上清液，采用CTAB、SDS 法或試劑盒再次提取其總DNA 進(jìn)行補(bǔ)充，以確保獲取菌株的遺傳信息.

圖2 細(xì)菌DNA 提取操作規(guī)程Fig.2 Operational procedure of bacteria DNA extraction

3 討論與結(jié)論

微生物資源獲取的過程中往往需要分離大量菌株，并通過16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增及測序了解其分類地位.因此，DNA 的提取成本和效率尤為重要.目前許多學(xué)者仍采用化學(xué)裂解的方法(如SDS、CTAB 等)提取細(xì)菌的總DNA［12-16］，這些方法不僅耗時(shí)耗力，且會(huì)產(chǎn)生大量的酚和氯仿等有機(jī)污染物.盡管市售的基因組DNA 提取試劑盒具有省時(shí)和效率高的優(yōu)點(diǎn)，但在菌株較多和經(jīng)費(fèi)有限的情況下成本依然較高.為此，本研究以來自14 個(gè)屬的革蘭陰性和陽性細(xì)菌菌株為研究對象，對4 種簡單提取細(xì)菌DNA 方法的效果進(jìn)行了比較.研究結(jié)果表明在細(xì)菌DNA 的提取效果上進(jìn)行排序，依次為凍融法、水煮法、堿解法、ROSE 法，凍融法效果最好，理論上，堿解法和ROSE 法采用化學(xué)作用的方式應(yīng)更有助于細(xì)胞的裂解和DNA 的釋放，但在實(shí)際操作過程中，我們發(fā)現(xiàn)部分細(xì)菌的胞內(nèi)物與化學(xué)裂解液反應(yīng)后會(huì)形成大量的黏稠狀物質(zhì)，這種現(xiàn)象在革蘭陽性菌中更為突出，而這2 種方法又缺少了酚/氯仿/異戊醇的純化步驟，使得DNA 釋放和溶解都較為困難，這些黏稠狀物質(zhì)可能也影響到了DNA 聚合酶的活性，導(dǎo)致部分菌株的PCR 擴(kuò)增失敗，嘗試采用高速離心仍無法解決該問題.錢雪琴等［17］對E.coli ATCC 25922 和Staphylococcus aureus ATCC 25923 利用堿解法提取DNA 用于PCR 擴(kuò)增也均告失敗.凍融法和煮沸法雖為物理作用裂解細(xì)胞，但在不同屬的供試菌株DNA 提取中均取得了較好的提取效果.與之相似，李淼等［18］采用煮沸法成功提取了凍土中144 株細(xì)菌的總DNA.在大量菌株的分離鑒定過程中，采用本研究中的操作流程獲取的PCR 產(chǎn)物可直接用于測序和克隆，在實(shí)現(xiàn)菌種保藏的同時(shí)，又縮減了DNA 提取的成本和時(shí)間，且減少了有機(jī)廢棄物對環(huán)境的污染，提高了細(xì)菌菌株遺傳信息的獲取效率.

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