張桂華1,李潤(rùn)成*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的具有高度傳染性和致死性的呼吸道疾病，該病發(fā)病急，死亡快，而且耐過(guò)豬和帶菌豬均是本病暴發(fā)和流行的潛在傳染源，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。感染動(dòng)物的典型臨床特征是肺壞死、出血和纖維素性滲出[2]。本文通過(guò)對(duì)分離的疑似胸膜肺炎放線桿菌進(jìn)行PCR鑒定及藥敏試驗(yàn)，為該病的診斷及防治提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料：病死豬的肺臟、心臟等病變組織。

1.1.2 主要培養(yǎng)基：巧克力瓊脂培養(yǎng)基，兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自貝瑞特生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）購(gòu)自美國(guó)Fluka公司。

1.1.3 主要試劑：各種藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；各種生化鑒定管購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；V因子（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物：8只18～22g昆明雌鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離：用接種環(huán)無(wú)菌挑取病豬肺臟和心臟病變組織，分別接種于兔血瓊脂培養(yǎng)基和巧克力瓊脂培養(yǎng)基，置燭缸中3 7℃培養(yǎng)12～24h，觀察生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察：挑取大小、形態(tài)一致的單個(gè)菌落，均勻涂布于滴有生理鹽水的載玻片上，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3 V因子（NAD）依賴(lài)試驗(yàn)：將分離菌分別接種于三種液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一種為無(wú)NAD含有犢牛血清的TSB，另一種為添加NAD和犢牛血清的TSB，同時(shí)設(shè)不加NAD和犢牛血清的對(duì)照管，37℃有氧條件下培養(yǎng)18h，觀察肉湯的渾濁度。

1.2.4 生化試驗(yàn)：先于生化管中加入V因子,使其終濃度達(dá)100μg/m L，然后按常規(guī)方法將分離的疑似胸膜肺炎放線桿菌分別接種于各種生化反應(yīng)管中，置3 7℃培養(yǎng)，2 4～4 8 h后觀察生化反應(yīng)情況。

1.2.5 P C R鑒定：根據(jù)已發(fā)表的胸膜肺炎放線桿菌的o m L A基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，序列如下：上游引物 Fp5’-GGCGGCTCATCGGGTTCAT-3’，下 游 引 物 Rp5’-TTTATCTTCTTTTGTGGTTGCC-3’。擴(kuò)增片段大小約為1029bp，PCR擴(kuò)增按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.2.6 動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)：將8只昆明雌鼠隨機(jī)分成兩組，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組4只。試驗(yàn)組每只小鼠按0.1mL/只腹腔注射菌液（將原培養(yǎng)物離心后用相同體積的TSB懸浮沉淀，細(xì)菌數(shù)約為2.4×107），對(duì)照組注射相同劑量的TSB。觀察小鼠生長(zhǎng)情況，對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖，觀察病變并分離培養(yǎng)細(xì)菌。

1.2.7 藥敏試驗(yàn)：將培養(yǎng)好的菌液均勻涂布于巧克力平板上，然后按常規(guī)的紙片法，貼上藥敏紙片，置燭缸中37℃培養(yǎng)，24h后觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及培養(yǎng)特性

該菌在兔血瓊脂平板上不生長(zhǎng)，在巧克力瓊脂平板上長(zhǎng)出針尖大小、半透明的呈粘性的菌落，鏡檢為革蘭氏陰性球桿菌；只在同時(shí)加有N A D和牛血清的T S B中變渾濁，另外兩管均不見(jiàn)渾濁。

2.2 生化試驗(yàn)

按1.2.5操作進(jìn)行生化試驗(yàn)，生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

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2.3 PCR鑒定

用設(shè)計(jì)的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌o m L A基因引物，對(duì)分離菌進(jìn)行P C R檢測(cè)，擴(kuò)增出了大小約為1 0 2 9 b p的特異性條帶，結(jié)果與預(yù)期的大小一樣，見(jiàn)圖1。

2.4 細(xì)菌致病性檢測(cè)

用分離的該純培養(yǎng)物給小鼠攻毒，約2 h后開(kāi)始發(fā)病，表現(xiàn)為被毛粗亂，擠堆，嗜睡，呼吸急促。試驗(yàn)組小鼠均在1 2 h內(nèi)死亡，個(gè)別死亡小鼠尿道處有紅色分泌物，鼻孔出血，對(duì)照組小鼠正常。解剖死亡小鼠，急性死亡的可見(jiàn)肺臟出血，從肺、脾、肝中均能分離到該細(xì)菌，解剖對(duì)照組小鼠則未見(jiàn)到任何病變。死亡小鼠臨床癥狀見(jiàn)圖2。

2.5 藥敏試驗(yàn)

共選用了1 8種藥物，極度敏感的藥物為頭孢噻吩，高度敏感的有新霉素、頭孢唑林、強(qiáng)力霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定、氧氟沙星、恩諾沙星、奈替米星及環(huán)丙沙星，中度敏感的藥物有氯霉素、大觀霉素、青霉素G、復(fù)方新諾明、頭孢他啶、卡那霉素及紅霉素，低敏感的藥物則是阿奇霉素，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

經(jīng)臨床初診和染色鏡檢，初步判定該菌可能為胸膜肺炎放線桿菌。結(jié)合NAD依賴(lài)性試驗(yàn)及生化鑒定結(jié)果，并與Kielstein[3]報(bào)道的豬N A D依賴(lài)的巴斯德氏菌科細(xì)菌的生化試驗(yàn)結(jié)果作比較，最終可以確定該菌為胸膜肺炎放線桿菌，P C R鑒定結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論，但是該分離菌不能產(chǎn)生H2S，與彭娟等[4]報(bào)道的A P P菌株不能產(chǎn)生H2S相符，但與陳凱[5]、刁友祥[6]報(bào)道的A P P菌株能夠產(chǎn)生H2S不符，這可能是由于菌株差異造成的。細(xì)菌致病性檢測(cè)表明該菌具有較強(qiáng)的致病性，這與該豬場(chǎng)生豬發(fā)病嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)相符。細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對(duì)頭孢噻吩極度敏感，對(duì)頭孢唑林、強(qiáng)力霉素、頭孢拉定、氧氟沙星等藥物高度敏感，對(duì)阿奇霉素則不敏感。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)本文分離的該株豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌沒(méi)有產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，采用敏感藥物預(yù)防和控制疾病的發(fā)展應(yīng)該能起到良好的作用。 □

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[1]Taylor DJ.Actinobacillus pleuropneumoniae.In:D’allaire S,Megeling WL,Taylor DJ,Straw BE,editors.Diseases of swine.8th ed.Ames,IA:Iowa State University Press;1999,343～54.

[2]Bosse JT,Janson H,Sheehan BJ,Beddek AJ,Rycroft AN,Kroll JS,et al.Actinobacillus pleruopneumoniae:pathobiology and pathogenesis of infection.Microbes Infect 2002;4(2):225～35.

[3]Kielstein P,Wuthe H,Angen O,Mutters R,Ahrens P.Phenotypic and genetic characterization of NAD～dependent Pasteurellaceae from the respiratory tract of pigs and their possible pathogenetic importance[J].Vet Microbiol,2001,81:243～255.

[4]彭娟,楊澤曉,宋勇,等.豬胸膜肺炎放線桿菌四川株的分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2011,38(10):221～223.

[5]陳凱,杜愛(ài)慶,張偉,等.淄博地區(qū)豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].山東畜牧獸醫(yī),2007,30(3):11～12.

[6]劉霞,刁友祥,趙樂(lè),等.豬胸膜肺炎放線桿菌的分離與鑒定[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2006,27(3):82～85.