王 湘，李潤成

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410131）

副豬嗜血桿菌引起的疾病又叫做革拉澤氏?。℅lasser’s Disease），可感染2周齡到4月齡的青年豬。臨床上表現(xiàn)為呼吸綜合征，特異性表現(xiàn)為纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎以及急性敗血病。副豬嗜血桿菌內(nèi)毒素可引起彌漫性血管內(nèi)凝血，導(dǎo)致不同組織微血栓的形成[1]。本文對湖南耒陽一豬場保育豬的發(fā)病情況做了簡要介紹，并對該豬場的保育豬發(fā)生副豬嗜血桿菌感染進(jìn)行了細(xì)菌分離及疾病的診斷分析，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料和方法

1.1 病料來源

湖南耒陽某豬場送檢的保育豬6頭，其中發(fā)病早期的1頭、中期的2頭、后期的3頭。（該豬場自2012年9月份開始50～80日齡的保育豬陸續(xù)出現(xiàn)皮毛粗亂，食欲減退，后期四肢腫大，不能站立的情況。發(fā)病率20%～30%左右，保育舍小豬總死亡率達(dá)10%左右）。

1.2 主要的試劑及培養(yǎng)基

Taq- plus 酶，dNTP、DNA Marker，革蘭氏染色試劑盒，巧克力培養(yǎng)基，血瓊脂培養(yǎng)基，TSB 培養(yǎng)基，NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），小牛血清。

1.3 送檢病豬的臨床與解剖病變觀察

將送檢病豬放于解剖室觀察其外部特征及行為表現(xiàn)后按常規(guī)方法處死并進(jìn)行解剖觀察、采樣。

1.4 細(xì)菌的分離

從采集的病豬脾臟、肺臟、關(guān)節(jié)液無菌鉤取組織樣本，劃線接種于巧克力及血瓊脂平板后，巧克力平板放于燭缸進(jìn)行培養(yǎng)，血平板直接放于恒溫箱中，37℃培養(yǎng)48 h后觀察細(xì)菌生長情況。

1.5 細(xì)菌的增菌培養(yǎng)及PCR鑒定

挑取形態(tài)上具有代表性的單個菌落劃線接種巧克力培養(yǎng)基，待菌落長出后進(jìn)行革蘭染色鏡檢和PCR鑒定。PCR鑒定采用細(xì)菌通用引物進(jìn)行，引物資料見文獻(xiàn)[2]，PCR方法按常規(guī)操作，并于PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司測序鑒定。

1.6 藥敏試驗(yàn)

挑取純培養(yǎng)的單個菌落，于含100μg/mL N A D的T S B液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)后采用紙片法進(jìn)行藥敏檢測。

2 結(jié)果

2.1 送檢病豬的臨床表現(xiàn)及解剖病變

從送檢的病豬可見6頭小豬均表現(xiàn)出消瘦，皮毛粗亂（圖1），其中有3頭發(fā)病后期的小豬四肢腫大(圖2)。6頭豬中只有2頭發(fā)病后期的豬表現(xiàn)出胸腔有嚴(yán)重的纖維素性滲出，1頭發(fā)病中期的小豬脾臟明顯腫大。其他均未見到嚴(yán)重病變。

2.2 細(xì)菌的分離、鑒定結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌分離及革蘭染色鏡檢結(jié)果

從采集的6頭小豬脾臟、肺臟、關(guān)節(jié)液分別無菌鉤取組織，劃線接種巧克力及血瓊脂平板。結(jié)果1頭發(fā)病初期以及2頭發(fā)病中期小豬脾臟接種的巧克力平板長出了一些形態(tài)一致的針尖大小菌落。其他均未見到細(xì)菌生長。劃線培養(yǎng)的細(xì)菌革蘭染色鏡檢均為絲狀陰性細(xì)菌（見圖3）。

2.2.2 PCR鑒定結(jié)果

挑取純培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并于PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。將測出序列進(jìn)行Blast 分析發(fā)現(xiàn)此次分離的菌株為副豬嗜血桿菌，為了進(jìn)一步確認(rèn)該菌株的血清型，使用Lasergene 分析軟件中的MegAlign 程序，運(yùn)用Clustal W方法對所測序列與參考序列進(jìn)行比較，并繪制和分析遺傳進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果表明，該菌株（LY.seq）與GenBank 中登錄的部分1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、14 血清型的16S rRNA 同源性為96.3%~99.0%，與GenBank登錄號為AB078974 以及AB078974 的兩株血清5 型的菌株構(gòu)成一個分支，同源性高達(dá)99.0%。因此將該分離株最后確認(rèn)為HPS 血清5 型細(xì)菌。

2.3 藥敏結(jié)果

挑取純培養(yǎng)的單個菌落，于含100 μg/mL NAD的TSB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)后，采用紙片法進(jìn)行藥敏檢測。抑菌圈直徑在15 mm以下，判為該菌對藥物低度敏感；直徑在15 mm～20 mm之間判為中度敏感；大于20 mm判為細(xì)菌對該藥極度敏感，建議此類藥物作為臨床用藥的首選。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

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由表1可見該細(xì)菌對頭孢噻吩、先鋒霉素V、強(qiáng)力霉素、氯霉素等藥物高度敏感，對慶大霉素、新霉素、環(huán)丙氟哌酸等藥物中毒敏感，對鏈霉素低度耐藥。

3 討論

豬是副豬嗜血桿菌的天然宿主。隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，副豬嗜血桿菌引起的疾病感染在我國各地也屢見不鮮且日益嚴(yán)重，疾病感染導(dǎo)致的高死亡率以及應(yīng)用大量抗生素治療給廣大養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在一個豬群中，副豬嗜血桿菌的致病力是影響全身疾病嚴(yán)重程度或發(fā)生、發(fā)展的因素，通?？梢詮呢i的上呼吸道分離出該菌的一些血清型，這其中包含了一些很少能從全身其他部位分離出的血清型，分離細(xì)菌的部位常影響副豬嗜血桿菌病判定的精確性。副豬嗜血桿菌可作為豬呼吸道疾病綜合征的病原體，也可以作為一種易感病原，或是作為引起肺炎的次要或主要病原體。當(dāng)動物機(jī)體感受到外部環(huán)境產(chǎn)生的壓力，如不良的飼養(yǎng)環(huán)境，斷奶、轉(zhuǎn)群、運(yùn)輸?shù)然蛏i存在藍(lán)耳病毒感染時，副豬嗜桿菌對生豬造成感染發(fā)病的機(jī)率會大大增加。單純的HPS感染時引發(fā)的臨床癥狀、剖檢病變以及流行病學(xué)特征與傳染性胸膜肺炎、支原體肺炎、以及豬的鏈球菌感染均有相似之處，在臨床上也很難進(jìn)行區(qū)分，所以在對該菌的感染進(jìn)行確診時需要借助實(shí)驗(yàn)室檢測手段。

副豬嗜血桿菌 15種血清型中 1、5、10、12、13、14為高致病性毒株；血清型2、4、15為中等毒力株；3、6、7、8、9、11為低致病力毒株，且感染豬后沒有明顯的臨床癥狀[3，4]，其中還有20%的菌株未能進(jìn)行分型。運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增細(xì)菌的16 SrRNA后進(jìn)行測序，將得到的序列與Gen Bank中的各血清型序列進(jìn)行比較，可以方便快速的鑒定副豬嗜血桿菌，提高了診斷HPS感染的效率。而且隨著分離菌株的增加，利用此方法也可以更好的收集HPS跟血清型感染的數(shù)據(jù)，為副豬嗜血桿菌病的防制提供了科學(xué)的參考依據(jù)。

此次送檢的病豬為6頭，病豬表現(xiàn)的臨床癥狀相似，結(jié)果卻只在發(fā)病的3頭小豬脾臟中分離到副豬嗜血桿菌，而在小豬明顯腫大的關(guān)節(jié)腔中卻未分離到細(xì)菌。經(jīng)過調(diào)查了解到該豬場在病豬送檢之前曾使用了大量的抗生素進(jìn)行治療，這可能是在關(guān)節(jié)液與肺臟中未分離到病原菌的原因之一。此次細(xì)菌分離提示臨床診斷副豬嗜血桿菌病例應(yīng)選用發(fā)病早期，且未經(jīng)抗生素治療的病豬作為診斷對象比較可靠。畜主在使用抗生素之前也應(yīng)對抗生素的種類進(jìn)行挑選與分析，避免盲目用藥后病原菌產(chǎn)生耐藥性。本文將該豬場保育豬病例診斷為存在副豬嗜血桿菌感染，并進(jìn)行藥物敏感性檢測，建議豬場采用敏感藥物進(jìn)行藥物保健與防控，取得了一定的效果。 □

[1] Amano H.,Shibata M.,Kajio N.,Morozumi T.Pathologic observations of pigs intranasally inoculated with serovar 1,4 and 5 of Haemophilus parasuis using immunoperoxidase method[J].Journal of Veterinary Medical Science,1994,56,639～644.

[2] Run-Cheng LI,Chao-Ting Xiao,Xing Qian,et al.Occurrence of Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis in Masked Palm Civet(Paguma larvata)[J].Journal of Animal and Veterinary Advances,2012,11(12)：2020～2023.

[3] Nielsen R.Pathogenicity and immunity studies of Haemophilus parasuis sexotypes[J].Acta Vet Scand,1993,34(2)：193～198.

[4] Kielstein P,Rapp-Gabrielson V J.Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts[J].J Clin Microbiol,1992,30：862～865.