舒 鵬貢婷潔（.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京009；.無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇無錫400）

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居于各種惡性腫瘤的前位[1-2]，對(duì)人類的生命和健康造成極大的威脅。我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)，預(yù)計(jì)今后若干年內(nèi)胃癌的發(fā)病率還將持續(xù)上升，其防治是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，也是我國(guó)對(duì)重大疾病防治工作的重點(diǎn)領(lǐng)域?；熓俏赴┑闹匾委熓侄?，然而新藥、新方案的出現(xiàn)并未能使其有效率顯著提高，中醫(yī)藥作為腫瘤綜合治療的手段之一被臨床廣泛應(yīng)用。目前普遍認(rèn)為中醫(yī)藥在預(yù)防腫瘤，增強(qiáng)患者的免疫功能，對(duì)放化療的解毒增效，抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及延長(zhǎng)患者的生存期，改善生活質(zhì)量等方面均有其獨(dú)特作用。多年來，大量臨床研究結(jié)果表明，以健脾養(yǎng)胃方為基礎(chǔ)的中醫(yī)藥治療可以降低胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[3]，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃腺癌SGC7901細(xì)胞，由江蘇省中醫(yī)院腫瘤科實(shí)驗(yàn)室提供。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司，新生牛血清購(gòu)自杭州四季清生物技術(shù)有限公司，胰酶蛋白粉、PBS粉、MTT（四甲基偶氮唑鹽）購(gòu)自Sigma公司，二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自上海凌峰公司。Matrigel膠、AnnexinV-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 健脾養(yǎng)胃方的制備健脾養(yǎng)胃方由生、炙黃芪，黨參，茯苓，炒白術(shù)，當(dāng)歸，白芍，陳皮，半夏，三棱，莪術(shù)，石見穿，白花蛇舌草，炒谷麥芽，焦楂曲，炙甘草組成。制備方法：將藥物加入10倍量水，浸泡1h，加熱2h，回收藥液，藥渣中加入之前一半量的水，再次煎煮2h后，回收藥液。合并2次藥液，過濾并濃縮至所需濃度，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。以上藥液由江蘇省中醫(yī)院制劑部提供。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)組：臨用前將中藥加入RPMI1640培養(yǎng)液，濃度分別為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL。空白組：不加任何藥物。西藥組：加入5-Fu。

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

2.3.1 酶聯(lián)免疫檢測(cè)藥物對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞增殖作用的影響[6-7]在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞達(dá)到指數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)開展實(shí)驗(yàn)。消化細(xì)胞，離心，收集細(xì)胞，接種于96孔板，置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)48h，使其貼壁生長(zhǎng)。吸棄培養(yǎng)液，加入含有不同濃度藥物的RPMI1640培養(yǎng)液200μL，繼續(xù)培養(yǎng)48h。傾倒培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加入200μL含10%小牛血清RPMI1640+20μLMTT培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸掉上清，每孔加入150μLDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。重復(fù)3次。

抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%

2.3.2 藥物對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞侵襲力的影響[8-9]按上述方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種于10cm培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)24h，使其貼壁生長(zhǎng)。加入含有不同濃度藥物的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。在濾膜的上下表面分別鋪以5μgmatrigel，超凈工作臺(tái)中過夜干燥。使用前水化基底膜，將transwell小室放入培養(yǎng)板中。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞饑餓處理，重懸于含無血清的培養(yǎng)基中。上室按1×106/mL密度加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入300μL含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液+300μL趨化因子，常規(guī)培養(yǎng)。24h后取出濾[4-5]膜，棉簽擦去濾膜上層細(xì)胞，移去小室，倒置，風(fēng)干；濾膜底部加50μL含0.1%結(jié)晶紫，風(fēng)干，PBS清洗；將膜取下，直徑上取5個(gè)視野，照相，計(jì)數(shù)。按以下公式計(jì)算細(xì)胞的侵襲抑制率：

細(xì)胞侵襲抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/空白組侵襲細(xì)胞數(shù)）×100%

2.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響[10-11]按上述方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)至細(xì)胞基本覆蓋培養(yǎng)皿底部。傾倒培養(yǎng)液，加入含有不同藥物的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)于 37℃、5%CO2溫箱。培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，收集所有細(xì)胞。加入300μL 1X Binding Buffer緩沖液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管中，加入5μL的FITC Annexin V、5μL 的PI，在避光處輕輕搖晃培養(yǎng)管，孵育細(xì)胞15min，25℃。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞周期的影響[12-13]接種細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)至細(xì)胞基本覆蓋培養(yǎng)皿底部。傾倒培養(yǎng)液，加入含有不同藥物的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)于37℃、5%CO2溫箱。培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞2次，消化，收集所有細(xì)胞。離心，再用PBS洗細(xì)胞2次，吸棄PBS。加入75%乙醇，于4℃固定4h

以上。1500r/min離心5min，棄上清，以3mL的PBS洗滌1次，加入400μL溴化乙錠（PI，50μg/mL），100μL RNase A（100μg/mL），4℃避光孵育30min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 藥物對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞增殖作用的影響結(jié)果見表1。健脾養(yǎng)胃方作用SGC7901細(xì)胞48h后，對(duì)細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。高劑量組藥物的抑制率可達(dá)88.06%，中劑量組的抑制率為56.70%，低劑量組的抑制率為34.24%。經(jīng)t檢驗(yàn)，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。

3.2 藥物對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞侵襲力的影響結(jié)果見表2。各組藥物作用SGC7901細(xì)胞24h后侵襲細(xì)胞數(shù)均低于空白組 （P＜0.001）?？瞻捉M細(xì)胞輪廓清晰、活力旺盛，各藥物組細(xì)胞變圓、稀疏，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性（見圖1）。

3.3 藥物對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響見表3、圖2。健脾養(yǎng)胃方高劑量、中劑量組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于空白組，并呈濃度依賴性，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系（P＜0.01）。

3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)健脾養(yǎng)胃方對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞周期的影響 結(jié)果見表4、圖3。不同濃度健脾養(yǎng)胃方作用48h，可以影響SGC-7901細(xì)胞周期分布，使G2/M期比例增

表1 各組藥物作用48h后SGC7901細(xì)胞增殖抑制率

表2 藥物作用24h后各組侵襲細(xì)胞數(shù)

圖1 藥物作用24h后各組SGC7901細(xì)胞侵襲力 注：A.空白組；B.健脾養(yǎng)胃方低劑量組；C.健脾養(yǎng)胃方中劑量組；D.健脾養(yǎng)胃方高劑量組

表3 藥物對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響

高，與空白組比較差異顯著（P＜0.05）。在健脾養(yǎng)胃方濃度達(dá)4mg/mL時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例增至17.64%，在G1峰前可見明顯凋亡峰。濃度為6mg/mL中藥組細(xì)胞死亡較多，結(jié)果無意義。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胃癌的發(fā)生與六淫、飲食、七情有關(guān)，脾胃虛弱是其基本病機(jī)，虛、痰、瘀、毒是其主要病理機(jī)制。我省名中醫(yī)劉沈林教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)胃癌脾胃虛弱這一主要病機(jī)，提出以健脾養(yǎng)胃為主的治療原則，并創(chuàng)健脾養(yǎng)胃方，在臨床上治療胃癌患者，特別是中晚期胃癌患者，取得了較好的臨床療效。該方由炙黃芪、黨參、炒白術(shù)、當(dāng)歸、白芍、莪術(shù)、石見穿、炙甘草等中藥組成。方中炙黃芪為補(bǔ)脾益氣之要藥，黨參、白術(shù)、甘草取四君子湯之意，益氣健脾；莪術(shù)、石見穿活血行氣消積。全方有健脾養(yǎng)胃、活血化瘀之功，正合胃癌脾胃虛弱之主要病機(jī)。多年來，我們運(yùn)用該方治療進(jìn)展期胃癌并進(jìn)行了大量的臨床研究，結(jié)果顯示其可以較好地緩解消化道腫瘤患者，特別是胃癌患者的臨床癥狀，恢復(fù)體力，增加體重，提高免疫功能，減輕其他治療的毒副反應(yīng)，降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。

本實(shí)驗(yàn)以人胃腺癌SGC7901細(xì)胞為載體，開展了健脾養(yǎng)胃方對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：健脾養(yǎng)胃方有抑制人胃腺癌SGC7901細(xì)胞增殖的作用，高劑量組對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率最高，達(dá)到88.06%；運(yùn)用健脾養(yǎng)胃方作用細(xì)胞24h后，侵襲的細(xì)胞數(shù)明顯減少；該方作用細(xì)胞48h后可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G2/M期周期阻滯。這一研究結(jié)果為健脾養(yǎng)胃方治療胃癌提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在此基礎(chǔ)上，我們還將對(duì)該方的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，以從分子層面深入探討其作用機(jī)制，為中藥復(fù)方治療腫瘤提供新的理論依據(jù)。

表4 健脾養(yǎng)胃方對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞周期的影響

圖3 健脾養(yǎng)胃方對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞周期的影響 注：A.空白組；B.1mg/mL健脾養(yǎng)胃方組；C.2mg/mL健脾養(yǎng)胃方組；D.4mg/mL健脾養(yǎng)胃方組

[1] Kamangar F，DoresGM，Anderson WF.Patternsofcancer

incidence，mortality，and prevalence across five continents：defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world.J Clin Oncol，2006，24：2137

[2] 徐飚，王建明.胃癌流行病學(xué)研究.中華腫瘤防治雜志，2006，13（1）：1

[3] 宋家駒.健脾中藥抗胃癌術(shù)后轉(zhuǎn)移的研究.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，13（22）：2956

[4] 徐大釗，蔡玉文.胃癌平誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（3）：638

[5] 鄒璽，王瑞平，胡玥.健脾化瘀藥物對(duì)消化道腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（1）：33

[6] 曲婷婷，徐大釗，蔡玉文.活血行氣方抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞株增殖及誘導(dǎo)其凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.解剖科學(xué)進(jìn)展，2010，16（6）：559

[7] 金松，辛國(guó)榮，孟繁石，等.菟絲子醇提物對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用研究.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2011，14（2c）：675

[8] 蘆曦，吳小翎，李艷，等.漢黃芩素體外抗人胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖、凋亡作用.中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46（7）：512

[9] 史海濤，董蕾，黨曉燕，等.中藥SPPW方劑對(duì)人胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（7）：921

[10] 李玉芳，仲寧，沈文香，等.姜黃素誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡.江蘇醫(yī)藥，2010，36（11）：1278

[11] 張?chǎng)?，洪寶，袁洪?吳茱萸堿誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞凋亡.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，26（5）：524

[12] 張珂，牟翰舟，馮建國(guó)，等.重樓醇提取物含藥血清對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞增殖和凋亡影響的觀察.中華腫瘤防治雜志，2011，18（12）：932

[13] 王寶慶，李艷春，泰文嬌，等.（±）2-（7，8，3′，4′，5′-五甲氧基）黃烷通過誘導(dǎo)周期阻滯和細(xì)胞凋亡抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（1）：52