藍如束 趙錦明 成詩明 周林 趙雁林 林玫 羅丹 劉飛鷹

結核?。═B）是HIV感染與AIDS患者最常見的機會性感染和最主要的死亡原因之一［1］。全球約有30%的HIV感染者潛在感染了TB［2］。HIV是目前使?jié)摲黅B感染成為活動性疾病的最大的風險因素［3］。HIV感染與AIDS患者合并結核病的雙重感染已成為目前預防控制和臨床診治的重點和難點。CD4＋T淋巴細胞是HIV感染的主要受損細胞，其計數(shù)作為直接測定免疫功能的方法，是HIV感染者免疫系統(tǒng)損害狀況最明確的指標。本研究通過對HIV感染與AIDS患者CD4＋T淋巴細胞計數(shù)，探討其與結核分枝桿菌痰培養(yǎng)及肺結核主要癥狀、體征之間的相關性，旨在為臨床早期診斷HIV感染與AIDS患者合并肺結核提供參考。

資料和方法

一、患者來源

納入2010年7月至2012年6月期間在廣西CDC、廣西龍?zhí)夺t(yī)院、南寧市第四人民醫(yī)院就診登記并確診為HIV感染與AIDS患者共733例。其中男573例（占78．2%），女160例（占21．8%）。年齡為5～84歲，平均年齡（45．49±14．98）歲。職業(yè)以農民為主，占62．8%（460／733）。臨床診斷合并活動性肺結核患者290例，占39．6%（290／733），其中痰涂片陽性患者37例；290例活動性肺結核患者均按國家標準化療方案進行抗結核治療。X線胸片檢查提示肺部有異常陰影（X線胸片異常）的患者有668例。133例患者正接受抗病毒治療，占18．1%（133／733），接受抗病毒治療時間中位數(shù)為150d。結核病的相關診斷依照參考文獻［4］進行。

二、方法

1．儀器和試劑：全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)儀BacT／ALERT?3D240由法國梅里埃公司生產(chǎn)，F(xiàn)ACSCalibur型流式細胞儀由美國BD公司生產(chǎn)；BacT／ALERT?3DMP處理瓶和分枝桿菌抗生素補充試劑盒（MB／BacT Antibiotic Supplement Kit）購于法國梅里埃公司，CD4－APC試劑購于美國BD公司，萋－尼染色液和改良中性羅氏培養(yǎng)基購于珠海貝索生物技術有限公司。H37Rv結核分枝桿菌標準菌株由中國CDC國家結核病參比實驗室提供。

2．臨床資料的采集：采用調查問卷方式采集相關臨床資料，問卷由中國CDC和廣西CDC專家共同設計，現(xiàn)場調查由經(jīng)過專業(yè)培訓的2名醫(yī)務人員完成。1名醫(yī)務人員負責進行面對面式詢問調查并逐項填寫問卷，另1名醫(yī)務人員對信息進行復核。調查內容包括患者一般信息（如患者性別、年齡、婚姻狀況、職業(yè)等）、HIV感染與AIDS患者確診的相關信息、肺結核癥狀、體征等。

3．結核分枝桿菌的培養(yǎng)：每例患者留3份痰（夜間痰、晨痰和即時痰），分別采用萋－尼染色方法進行痰涂片找抗酸桿菌和BacT／ALERT?3D進行分枝桿菌培養(yǎng)，操作步驟嚴格按文獻［5］和文獻［6］中的規(guī)定進行。涂片采用萋－尼染色方法進行染色鏡檢。分枝桿菌培養(yǎng)操作要求：選取2份痰涂片結果陽性級別高或涂片結果陰性、痰質量好的標本進行培養(yǎng)。取1～2ml標本于50ml無菌離心管內，加入1～2倍體積4%NaOH，液化去污染15min，加入磷酸鹽緩沖液（pH值為6．8）至50ml，擰緊蓋子漩渦振蕩混勻，3000×g離心15min，棄上清液后，加入1ml磷酸鹽緩沖液混勻，用1ml無菌注射器無菌操作吸取1ml混勻液，取0．5ml注入BacT／ALERT?3DMP處理瓶，放入BacT／ALERT?3D全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)儀進行培養(yǎng)，陽性結果儀器自動報警，42d無菌落生長則可報陰性結果。再按傳統(tǒng)方法接種0．1ml混勻液于2支改良中性羅氏培養(yǎng)基斜面，置于36℃恒溫培養(yǎng)，接種后第3、7天各觀察1次菌落生長情況，此后每周觀察1次。如果有菌落生長需進一步做菌種鑒定，60d無菌落生長報陰性結果。每批固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基均同時采用標準結核分枝桿菌“H37Rv菌株”作為質控菌株。質控方法和結果判斷，分別取0．5ml和0．1ml 1個麥氏單位H37Rv標準菌株菌懸液接種到被測試液體培養(yǎng)和改良中性羅氏培養(yǎng)，按以上方法進行培養(yǎng)。如果液體培養(yǎng)在7～10d內生長，改良羅氏培養(yǎng)在10～20d菌落生長說明培養(yǎng)基合格。

4．CD4＋T細胞的檢測：用FACSCalibur型流式細胞儀進行四色熒光抗體標記檢測。采集患者靜脈全血約2～3ml，注入已加乙二胺四乙酸K3（EDTA－K3）抗凝劑的流式細胞檢測試管中，混勻，置室溫20～25℃。取20μl試劑于每個TruCOUNT管中，并用反向抽吸法準確加入50μl待檢標本，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。加入450μl的1×溶血素裂解液（FACS lysing solution），輕輕混勻，室溫避光放置15min，待紅細胞完全裂解，即可上機檢測。應用Multi SET全自動淋巴細胞免疫表型檢測分析軟件，對外周血直接多色熒光進行分析，獲得關于外周血中淋巴細胞各類亞型細胞的信息，經(jīng)分析軟件處理自動算出檢測結果。

5．分枝桿菌的鑒定：采用結核分枝桿菌MPB64抗原檢測膠體金法，抗酸桿菌陽性培養(yǎng)物經(jīng)萋－尼染色鏡檢確認為抗酸桿菌后，采用分枝桿菌抗原檢測膠體金法（MPB64）鑒定結核分枝桿菌復合群和非結核分枝桿菌。直接用1ml注射器吸取BacT／ALERT?3DMP處理瓶中液體100μl加入到結核分枝桿菌膠體金試驗板的檢測孔中，15min后觀察結果。結果判定：檢測區(qū)和質控區(qū)均出現(xiàn)紫紅色條帶為陽性結果，判定為結核分枝桿菌復合群，后再經(jīng)對硝基苯甲酸（PNB）、噻吩－2－羧酸酰肼（TCH）鑒別培養(yǎng)基鑒別為結核分枝桿菌；在質控區(qū)出現(xiàn)紫紅色條帶，而在檢測區(qū)未出現(xiàn)條帶則為陰性結果，判定為非結核分枝桿菌；如果質控區(qū)未出現(xiàn)任何條帶說明試劑失效，需重新檢測。每批試劑和鑒定培養(yǎng)基均同時采用標準結核分枝桿菌“H37Rv菌株”作為質控菌株。MPB64試驗板檢測區(qū)和質控區(qū)均出現(xiàn)紫紅色條帶，說明試劑合格，反之失效。取0．1ml 1個麥氏單位H37Rv標準菌株菌懸液接種到被測試PNB和TCH培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)30d。如果PNB無菌生長，TCH有菌生長說明鑒定培養(yǎng)合格，反之不合格。

三、CD4＋T細胞分級

根據(jù)CD4＋T淋巴細胞數(shù)的多少分為4級［7－9］，1級：＞300個／μl；2級：200～300個／μl；3級：100～200個／μl；4級：＜100個／μl（因為進行t檢驗的兩樣本的總體方差不等，所以必須對CD4細胞計數(shù)進行對數(shù)變量變換后再進行t檢驗，以lg轉換取其自然對數(shù)。另外，本研究CD4細胞計數(shù)的分級及進行變量變換前的計數(shù)單位均為“個／μl”）。

四、統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)資料采用EpiData 3．1軟件進行雙錄入并核查，采用SPSS 19．0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。CD4＋T淋巴細胞計數(shù)分級與痰培養(yǎng)陽性的相關性采用卡方檢驗。對CD4＋T淋巴細胞計數(shù)進行對數(shù)變換后對其差異性進行獨立樣本t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、CD4＋T淋巴細胞計數(shù)級別與痰培養(yǎng)陽性的關系

733例HIV感染與AIDS患者中，分枝桿菌痰培養(yǎng)陽性172例，其中結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性118例，結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率為16．1%。不同CD4＋T淋巴細胞計數(shù)級別的結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率見表1。經(jīng)檢驗，不同CD4＋T淋巴細胞計數(shù)級別間結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率之間的差異無統(tǒng)計學意義（χ2趨勢性＝2．004，P＝0．157）。患者不同級別CD4＋T淋巴細胞計數(shù)與結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性結果之間具有相關性（r＝－0．048，P＝0．035）。

表1 患者CD4＋T淋巴細胞計數(shù)級別與痰培養(yǎng)陽性率的關系

二、CD4＋T淋巴細胞計數(shù)與肺結核主要癥狀、體征的關系

對HIV感染與AIDS患者進行CD4＋T淋巴細胞計數(shù)，并且與是否咳嗽、咯痰＞2周、有無X線胸片異常、分枝桿菌痰培養(yǎng)結果，以及是否為活動性肺結核等的差異進行分析；結果顯示，HIV感染與AIDS患者是否咳嗽、咯痰＞2周中CD4＋T淋巴細胞計數(shù)的差異有統(tǒng)計學意義，有咳嗽、咯痰＞2周癥狀的患者CD4＋T淋巴細胞計數(shù)低于無該癥狀的患者（P＝0．009）（表2）。

表2 有無肺結核主要癥狀、體征患者在CD4＋T淋巴細胞計數(shù)中的差異分析

討 論

HIV感染與AIDS患者的病情進展可以促使肺結核感染的加速發(fā)展，而反過來肺結核也可以促使HIV感染者發(fā)展為AIDS患者［10］，兩者具有密切關系。CD4＋T淋巴細胞的高低可反映HIV感染與AIDS患者疾病的嚴重程度，并且AIDS患者T淋巴細胞計數(shù)越少，并發(fā)結核病的可能性就會越大［11］。本研究對HIV感染與AIDS患者的CD4＋T淋巴細胞計數(shù)與結核分枝桿菌痰培養(yǎng)結果、肺結核主要臨床癥狀、X線胸片結果及有關臨床資料進行相關性分析。結果顯示，HIV感染與AIDS患者不同CD4＋T淋巴細胞計數(shù)級別間結核分枝桿菌痰培養(yǎng)陽性率的差異無統(tǒng)計學意義，但是CD4＋T淋巴細胞計數(shù)級別與結核分枝桿菌痰培養(yǎng)陽性率是具有相關性的。因此，對于CD4＋T淋巴細胞計數(shù)較低的HIV感染與AIDS患者，在結核分枝桿菌痰培養(yǎng)結果出來之前，臨床上應考慮其合并活動性肺結核的可能，以便早期采取相應的治療管理措施。HIV感染與AIDS患者結核分枝桿菌痰培養(yǎng)陽性率較低，考慮可能與肺部病變很少發(fā)生組織破壞、少有空洞形成有關，但其常有菌血癥，發(fā)現(xiàn)肺外結核或進行血液骨髓培養(yǎng)可提高診斷陽性率［12］。

咳嗽、咯痰＞2周是肺結核患者最主要的臨床癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染與AIDS患者中出現(xiàn)咳嗽、咯痰＞2周者其CD4＋T淋巴細胞計數(shù)低于未出現(xiàn)該癥狀者。因此，對于出現(xiàn)該癥狀的HIV感染與AIDS患者，應該警惕合并肺結核的可能。在臨床工作中，應加強臨床監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)有無異常情況，以免延誤治療的最佳時期。

本研究結果顯示，HIV感染與AIDS患者中結核分枝桿菌痰培養(yǎng)結果陽性和陰性的CD4＋T淋巴細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，考慮可能與患者選擇的范圍有關（本研究患者納入僅限于在醫(yī)院登記就診的患者），應擴大抽樣范圍及樣本量，盡可能避免選擇偏倚，從而得出更準確的結論。同時也發(fā)現(xiàn)，HIV感染與AIDS患者X線胸片檢查結果是否異常，患者間CD4＋T淋巴細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，考慮與本研究納入的患者CD4＋T淋巴細胞計數(shù)較低有關［CD4＋T淋巴細胞計數(shù)小于10個／μl的患者占總患者數(shù)的20%，CD4＋T淋巴細胞計數(shù)小于100個／μl的患者占總患者數(shù)的70%（CD4＋T淋巴細胞分級無統(tǒng)一標準，本研究分級是參考的文獻［7－9］）。之所以出現(xiàn)4級患者數(shù)占總患者數(shù)的70%，是因為本研究納入的患者絕大部分來源于醫(yī)院，正因為CD4＋T細胞較低，所以需要在醫(yī)院接受相應的治療。本研究的結果僅代表在該分級情況下的研究結果］。而CD4＋T淋巴細胞計數(shù)越低，肺部影像學征象越不典型［7］。相關文獻也表明AIDS合并肺結核患者的影像學表現(xiàn)復雜多樣，呈不典型肺結核改變，特異征象較少［13－15］。提示臨床上對于HIV感染與AIDS患者，僅僅按照是否具有肺結核X線胸片的陽性癥狀，并不能作為是否合并肺結核的診斷指征之一，應考慮免疫抑制（CD4＋T淋巴細胞計數(shù)下降有關）的可能。

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