陳曉鵬，楊來志，葛國朝，崔巍，屠佳，田野

(皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院肝膽一科，安徽蕪湖 241001)

乙酰肝素酶(也稱類肝素酶，heparanase，HPSE)是一種糖苷內切酶，它通過降解細胞外基質硫酸乙酰肝素蛋白多糖，在腫瘤轉移及血管生成等病理過中發(fā)揮重要作用，并在多數(shù)惡性腫瘤細胞高水平表達［1-2］。故深入研究HPSE基因的轉錄調控機制，對于合理調節(jié)其表達水平、探討腫瘤生物治療的新方法具有重要意義［3］。我們前期在克隆HPSE啟動子核心片段的基礎上分析發(fā)現(xiàn)，該啟動子雖可驅動下游基因在腫瘤細胞特異性表達，但活性較低［4-5］。本研究我們擬對HPSE基因啟動子上、下游鄰近序列進行分段擴增，并分別分析其促轉錄活性，為進一步篩選、鑒定其增強子序列奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細胞和儀器

DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、PFX、dNTP、PCR Buffers(Takara 公司);PCR純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒(北京道普公司);無內毒素質粒大提試劑盒(北京天能生物技術有限公司);T4 DNA ligase、限制性內切酶KpnⅠ、SalⅠ、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞、pEGFP-N1質粒和各種引物(上海生工生物公司合成);胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂(英國Oxoid公司);Lipofectamne 2000、DMEM培養(yǎng)基和RPIM-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)。人肝癌細胞BEL-7402、胃癌細胞SGC-7901(上海中科院細胞庫)。PCR擴增儀(BIORAD公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)，倒置顯微鏡(OLYMPUS公司);熒光顯微鏡(Nikon公司);FC500MPL流式細胞儀(Backman公司)。

1.2 候選序列的確定

根據(jù)HPSE之DNA序列，設計選取10個片段作為增強子候選序列(enhx，x分別為1，2……10)，其中啟動子上游6段，啟動子下游4段，每個片段共1 200 bp，為避免相鄰片段之間將增強子序列截為兩個部分，在兩相鄰片段之間重疊200 bp。

1.3 重組質粒的構建與鑒定

改造載體 PEGFP-N1中的 VspⅠ位點，增加KpnⅠ、SalⅠ酶切位點，退火引物為taatGGCGCGCCaa tcgaaGGTACCgacaaACGCGTatccgaGTCGACat和taatGTC GACtcggatACGCGTttgtcGGTACCttcgattGGCGCGCCat，改造的質粒命名為pEGFP-MU，作為本研究的陰性對照載體。化學方法合成猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)增強子序列，全長237 bp。測序鑒定SV40增強子序列合成正確，設計引物，PCR擴增，并增加酶切位點(12 bp)，其中上游KpnⅠ酶切位點GGTACC，下游SalⅠ酶切位點GTCGAC，引物由上海生物工程有限公司合成。反應體系 50 μl，反應條件:95℃預變性5 min，94 ℃ 55 s，57 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，共35 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min;將擴增的片段插入到質粒pEGFP-MU的KpnⅠ和SalⅠ兩酶切位點之間，構建載體pEGFP-MU-SV40e;將連接反應液轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性菌落、提取質粒DNA，分別雙酶切和PCR擴增、測序鑒定，正確者作為本實驗的陽性對照載體。根據(jù)HPSE之DNA序列設計引物，從人血基因組中PCR擴增上述候選增強子序列1～10，并增加上述酶切位點，上游Kpn I位點后面序列分別與候選增強子enhx序列5'端吻合，下游SalⅠ位點后面序列分別與enhx序列3'端互補，預計enh6擴增序列長度為1 092 bp(包括完整的序列1 080 bp和酶切位點12 bp)，其余片段擴增序列長度為1 212 bp(包括完整的候選增強子序列1 200 bp和酶切位點12 bp)。同法構建實驗載體pEGFP-MU-enhx并鑒定。

1.4 質粒轉染和功能分析

人腫瘤細胞株BEL-7402、SGC-7901常規(guī)方法復蘇、傳代、凍存和培養(yǎng)。提取質粒，選取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的細胞，待融合度達80%調整細胞計數(shù)，使用6孔板鋪板，細胞轉染按照Lipofectamine 2000說明書操作。在37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育細胞40 h。貼壁細胞用0.25%的胰酶消化后，用含血清培養(yǎng)基終止消化。所有轉染條件相同，轉染時間為48 h，然后進行熒光顯微鏡下觀察和流式細胞分析，檢測熒光強度和轉染效率。實驗重復3次，取平均值。

2 結 果

2.1 對照質粒的構建和鑒定

SV40增強子PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增條帶(長度為249 bp，包括SV40增強子的完整序列和酶切位點12 bp)與預期的SV40增強子237 bp片段基本符合，條帶清晰。構建的pEGFP-MU-SV40e載體行KpnⅠ和SalⅠ雙酶切電泳可見2個片段，單一酶切均僅有1個片段，初步證明載體構建正確。以pEGFP-MU-SV40e重組質粒為模板，可擴增出長為SV40增強子序列片段，測序結果包含完整的SV40增強子序列，與GenBank一致。對比一致是從33 bp處至269 bp處，長度為237 bp。從 27～32 bp處為GGTACC是KpnⅠ酶切位點，從270～275 bp處為GTCGAC是SalⅠ酶切位點(圖1)。

圖1 SV40增強子PCR產物部分測序圖Fig 1 Partial sequencing graph of PCR product of SV40 enhancer

2.2 實驗載體pEGFP-MU-enhx的構建和鑒定

10個候選序列PCR產物分別經1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增條帶與預期長度1 200 bp片段符合。構建的pEGFP-MU-enhx載體行KpnⅠ和SalⅠ雙酶切電泳可見2個片段，單一酶切均僅有1個片段，初步證明載體構建正確。以pEGFP-MU-enhx重組質粒為模板，可擴增出長為1 200 bp左右的候選增強子序列片段，測序結果包含了完整的候選序列，與GenBank一致(圖2)。對比一致是從33 bp處至1 232 bp處，長度為1 200 bp;27～32 bp處為GGTACC是KpnⅠ酶切位點，1 233～1 238 bp處為GTCGAC是SalⅠ酶切位點。

2.3 重組質粒的真核表達與功能分析

陰性對照質粒pEGFP-MU轉染BEL-7402和SGC-7901細胞后熒光強度較弱;陽性對照質粒pEGFP-MUSV40e、實驗載體 pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8轉染BEL-7402和SGC-7901細胞后熒光強度較強，其余實驗載體熒光強度與陰性對照相似(圖3、4)。流式細胞儀分析中以發(fā)光細胞百分比代表細胞的轉染效率。質粒pEGFP-MU在BEL-7402和SGC-7901細胞中的轉染效率較低，質粒pEGFPMU-SV40e、實驗載體 pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8轉染效率較高，其余實驗載體轉染效率與陰性對照相似，效率較低(見表1)。

圖2 第7候選片段PCR產物部分測序圖Fig 2 Partial sequencing graph of of PCR product of the 7thcandidate DNA fragment

圖3 各組質粒轉染BEL-7402細胞熒光圖Fig 3 Fluorogram of various kinds of plasmids in BEL-7402 cell

表1 各種載體在腫瘤細胞中的轉染效率比較%Tab 1 Comparison of transcription efficiency of various kinds of plasmids in tumor cells %

3 討 論

圖4 各組質粒轉染SGC-7901細胞熒光圖Fig 4 Fluorogram of various kinds of plasmids in SGC-7901 cell

增強子是基因內的一種DNA特異序列，能夠增強DNA轉錄活性，可與細胞核內轉錄因子(TF)特異結合從而極大地增強啟動子活性。其結構與啟動子相似，也由多個元件組成，通常為100～200 bp長度，核心組件8～12 bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在［6］。每個基因至少包含一個增強子，既可以定位于基因的兩端，也可以定位在基因中間，甚至遠離基因多達數(shù)千個核苷酸。但與基因編碼序列不同，增強子無法僅僅根據(jù)DNA序列加以識別，必須通過實驗證實。鑒定增強子的實驗方法主要有DNA結構分析、序列分析和基因刪除和替換等，軟件預測是鑒定增強子的另一種方法，但不同的軟件預測差異較大，而且結果仍需實驗來驗證［7］，尚難普遍應用。

本研究在前期發(fā)現(xiàn)SV40增強子可增強HPSE啟動子表達活性［8］的基礎上，參考其他文獻［9-10］，選用HPSE基因啟動子上、下游的部分片段作為候選序列，將其分為10段，在其上、下游引物分別添加KpnⅠ和SalⅠ酶切位點，進行PCR擴增，將其克隆插入到含有巨細胞病毒(CMV)啟動子、并經改造過的真核表達載體pEGFP-MU中，構建重組載體pEGFP-MU-enhx。然后分別轉染腫瘤細胞株BEL-7402、SGC-7901，通過免疫熒光觀察和流式細胞儀分析方法檢測增強子候選序列對CMV啟動子轉錄活性的影響，以初步鑒定出具有增強子活性的候選序列。

為準確判斷候選序列活性，本研究以未插入其他序列的質粒pEGFP-MU作為陰性對照。SV40增強子是最早發(fā)現(xiàn)也是迄今功能最強大的病毒增強子，其核心序列是由72 bp的堿基對重復序列構成。研究［11］表明SV40增強子修飾的人端粒酶逆轉錄酶啟動子可以提高轉錄活性2～3倍，而且不影響其腫瘤特異性。我們前期研究［8］也證明，SV40增強子可以增強HPSE啟動子的轉錄活性。本研究中我們采用PCR擴增克隆出SV40增強子序列，并引入KpnⅠ和SalⅠ酶切位點，然后將其插入到改造的質粒pEGFP-MU序列中CMV啟動子上游KpnⅠ和SalⅠ酶切位點之間，構建重組質粒載體pEGFP-MU-SV40e，作為本研究陽性對照載體。電泳和測序結果表明，陽性對照質粒構建成功。

將上述3種質粒分別轉染腫瘤細胞株BEL-7402、SGC-7901，通過免疫熒光觀察和流式細胞儀分析方法檢測各個片段對CMV啟動子轉錄活性的影響，以初步鑒定出具有增強子活性的候選序列。

在同等條件下，將質粒pEGFP-MU、pEGFP-MUSV40e和pEGFP-MU-enhx分別轉染人腫瘤細胞BEL-7402和SGC-7901。48 h后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)重組質粒pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFPMU-enh8e在人腫瘤細胞BEL-7402和SGC-7901中均表達較強的熒光，與陽性對照pEGFP-MU-SV40e相似。其余質粒比陽性對照pEGFP-MU-SV40e低，與陰性對照pEGFP-MU較接近。流式細胞儀與熒光觀察結果一致。初步提示第6、7和8活性片段可以增強CMV啟動子(驅動熒光蛋白表達)轉錄活性，且與SV40增強子相當。

腫瘤特異性啟動子可驅動目的基因的靶向表達，增強子能夠協(xié)同啟動子顯著增強治療基因的表達水平。本研究初步篩選、鑒定了HPSE序列中具有增強子活性的3個DNA片段，為后續(xù)進一步篩選和鑒定有活性的增強子序列縮小了序列搜尋范圍，并為將來利用HPSE增強子進行腫瘤基因治療提供了實驗依據(jù)，具有廣闊的應用前景。

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