高獻禮，閆 爽，陳燕斌，陸 健*

(1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫2141222;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122)

據(jù)中國產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示(http://data.chyxx.com/shpyl/201103/K 79165 A8GP.html)，2011年我國醬油產(chǎn)量達662萬t，是我國調(diào)味品和食品工業(yè)的重要組成部分。但隨著我國人民生活水平的不斷提高和國外(主要是日本、韓國)高檔次醬油進入國內(nèi)市場，消費者不但要求醬油具有良好的調(diào)味、去腥和上色功能，而且對醬油的外觀質(zhì)量(如是否有沉淀、長霉等)的要求也越來越高。近些年消費者對國產(chǎn)醬油投訴最多，也是我國醬油行業(yè)普遍存在的質(zhì)量問題，即醬油在儲存和銷售過程中的沉淀(醬油腳)問題，其嚴重影響了產(chǎn)品的外觀穩(wěn)定性、消費者的購買欲和企業(yè)的形象，導(dǎo)致企業(yè)競爭力下降［1－4］。因此，醬油企業(yè)要提高市場競爭力，必須提高產(chǎn)品質(zhì)量，而解決醬油的沉淀問題是其需要解決的首要問題。目前國內(nèi)外對醬油二次沉淀形成的機理及影響因素的研究仍然存在爭議或不夠深入。如國內(nèi)學(xué)者認為醬油二次沉淀的產(chǎn)生主要是醬油中的部分疏水性較強的蛋白質(zhì)引起的，受多糖、脂肪、鹽等的影響較?。?－8］。而日本學(xué)者指出醬油二次沉淀受醬油的熱凝性影響，生醬油中存在促進醬油二次沉淀形成的促沉因子。曲霉中的蛋白酶、α－淀粉酶、果膠裂解酶、木聚糖酶等對醬油的熱凝結(jié)起促進作用，其中以堿性和中性蛋白酶的影響最大［9－10］。此外，Pedro等［11］研究結(jié)果顯示非特異性蛋白酶 α－胰蛋白酶在高濃度鹽的作用下能夠生成類蛋白，這種類蛋白的疏水性比底物高得多，而這種類蛋白可以通過轉(zhuǎn)肽作用富集疏水性氨基酸，生成不溶于水的疏水性肽類，濃縮成小顆粒后，形成不溶于水的類蛋白。由以上分析可知，國內(nèi)外學(xué)者對醬油二次沉淀的主要成分及其機理進行了初步的研究，但對導(dǎo)致醬油二次沉淀形成的主要成分、影響因素和機理并未形成被廣泛認可的共識。本文基于統(tǒng)計學(xué)原理，以pearson相關(guān)性分析法研究了醬油各指標與醬油二次沉淀形成的相關(guān)性，以T檢驗法研究了醬油不同發(fā)酵方式、類型、原料、質(zhì)量等級和產(chǎn)地對醬油二次沉淀形成的影響，為進一步深入認識導(dǎo)致醬油二次沉淀形成的主要成分、機理及影響因素提供實驗數(shù)據(jù)和方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料見表1。硫酸銅、亞甲基藍、酒石酸鉀、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、硝酸銀、鉻酸鉀、甲醛溶液、考馬斯亮藍G－250、乙酸鎂、四硼酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈣、檸檬酸、Tris、SDS、過硫酸銨、溴酚藍、無水乙醇、冰醋酸 均為分析純，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司。

FE20實驗室pH計 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;Kjeitec2300凱氏定氮儀 瑞典FOSS分析儀器有限公司;WFZ UV－2100紫外分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;H1850R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;5415D高速離心機 德國艾本德(Eppendorf)股份公司;Freezone 4.5真空冷凍干燥機 美國Labconco公司。

1.2 實驗方法

將表1中各醬油樣品常溫下靜置7d以上，取上清液進行以下理化指標的測定。

1.2.1 pH的測定 FE20 pH計直接測定。

1.2.2 還原糖和總糖的測定 還原糖的測定方法參照GB/T 5009.7－2003法?？偺堑臏y定方法如下:吸取樣品2～10mL(控制樣品總糖含量 1～2g/L)于500mL容量瓶中，加水50mL和6mol/L鹽酸5mL，68～70℃水浴加熱15min。冷卻后加入甲基紅指示液2滴，用200g/L的NaOH溶液滴定至紅色消失(近中性)。加水定容、搖均、冷卻后備用。其他步驟參照還原糖測定方法GB/T 5009.7－2003。

1.2.3 NaCl的測定 NaCl含量的測定方法參照GB/T 5009.39－2003。

1.2.4 氨基酸態(tài)氮和總氮的測定 氨基酸態(tài)氮和總氮的測定方法分別參照GB/T 5009.40－2003和微量凱氏定氮法GB 5009.5－85。

1.2.5 無鹽固形物含量的測定 無鹽固形物含量的測定方法參照GB 18186－2000方法。

表1 醬油樣品基本信息Table 1 Information of soy sauce samples

1.2.6 沉淀制備方法 醬油二次沉淀制備方法參照文獻［12］，修改如下:將 500mL醬油搖均后在4500r/min、4℃ 下離心 30min，去除上清，分別用10mL上清洗滌沉淀3次并轉(zhuǎn)入50mL離心管中。同樣在4500r/min、4℃下離心30min，棄上清，收集沉淀。將收集的沉淀在－40℃下冷凍4h，樣品進行抽真空冷凍干燥，最后在105℃烘干至恒重得醬油二次沉淀。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)測定3次，取其平均值。運用SPSS 11.5軟件進行 Pearson相關(guān)性分析和Independent－Samples T Test分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 醬油理化指標測定結(jié)果

由表2可知，25種市售醬油的pH、總糖、還原糖、NaCl、總氮、氨基酸態(tài)氮、無鹽固形物及二次沉淀含量的變化范圍分別為4.18～5.29、17.23～78.32g/L、10.76～45.65g/L、11.00～19.45g/100mL、0.28～2.04g/100mL、0.15～1.48g/100mL、7.86～34.32g/100mL、0.18～2.98g/L。其中25種市售醬油二次沉淀含量的平均值和標準偏差為:(0.90±0.74)g/L。

表2 醬油中各理化指標的測定結(jié)果Table 2 Determination results of physicochemical indices of soy sauces

2.2 醬油理化指標與二次沉淀形成的相關(guān)性分析

由表3可知，經(jīng)pearson相關(guān)性分析得出醬油二次沉淀的形成與醬油中總糖、總氮和無鹽固形物含量呈顯著性相關(guān)，而與醬油pH及還原糖、NaCl、氨基酸態(tài)氮含量無統(tǒng)計學(xué)意義上的相關(guān)性。曾新安等［5］和張志航等［7］通過理化分析得出蛋白質(zhì)和多糖是醬油二次沉淀的兩類主要成分，本文通過統(tǒng)計學(xué)分析證明醬油中總氮和多糖含量與醬油二次沉淀的形成密切相關(guān)。此外，蛋白質(zhì)和多糖是醬油無鹽固形物的主要組成部分，其含量與醬油二次沉淀形成密切相關(guān)具有理論上的合理性。此外，曾新安等［5］的分析結(jié)果表明醬油二次沉淀的形成與NaCl含量及pH無關(guān)，這與本文基于統(tǒng)計學(xué)原理分析的結(jié)果一致。

2.3 影響醬油二次沉淀形成因素的分析

由表4可知，不同質(zhì)量等級醬油的二次沉淀含量存在較大差異，如特級醬油分別比一級/二級醬油和三級醬油二次沉淀含量高148.89%和21.74%，說明質(zhì)量等級對醬油二次沉淀含量具有較大影響，即質(zhì)量等級越高、總氮含量越高，其二次沉淀含量可能越高(本研究一級/二級醬油樣本偏少，對分析結(jié)果可能有一定的影響)。與東北/日本產(chǎn)醬油相比，華南、華東、華北產(chǎn)醬油二次沉淀的含量分別比東北/日本產(chǎn)醬油二次沉淀含量高 90.57%、94.34%、64.15%，說明不同產(chǎn)區(qū)對醬油二次沉淀的形成有明顯的影響?？赡艿脑驗槲覈鴸|北地區(qū)及日本與我國的華南、華東和華北地區(qū)存在較為明顯的年平均氣溫差異(http://info.datang.net/Z/images/6213－b01.jpg)，而發(fā)酵溫度對醬油二次沉淀的形成具有重要影響［4，13］。此外，由表 4 可知，不同發(fā)酵方式和主要生產(chǎn)原料對醬油二次沉淀的形成也存在明顯的影響。如低鹽固態(tài)醬油比高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀含量高49.37%;以大豆為主要原料生產(chǎn)的醬油比以豆粕為主要原料生產(chǎn)的醬油的二次沉淀含量高51.95%。但不同類型醬油(老抽和生抽)之間的二次沉淀含量差異較小(15.12%)。

表3 醬油各理化指標與醬油二次沉淀形成相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Analysis results of correlation between physicochemical indices and secondary sediments of soy sauces

表4 醬油二次沉淀含量經(jīng)T Test檢驗分析結(jié)果Table 4 Results of secondary sediment contents of soy sauces analyzed by T Test

3 結(jié)論

本文基于統(tǒng)計學(xué)分析法研究了醬油pH及總糖、還原糖、NaCl、總氮、氨基酸態(tài)氮、無鹽固形物含量與醬油二次沉淀形成的相關(guān)性及影響醬油二次沉淀形成的因素。得出如下結(jié)論:

3.1 醬油二次沉淀的形成與醬油中總糖、總氮和無鹽固形物的含量顯著性相關(guān)。

3.2 醬油發(fā)酵方式、主要原料、質(zhì)量等級和產(chǎn)地對醬油二次沉淀的形成具有較大影響，而醬油類型對醬油二次沉淀的形成無明顯的影響。

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