杜越歐，侯俊財

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌，能夠在厭氧或兼性厭氧條件下發(fā)酵己糖產(chǎn)生乳酸，形成與人類生活密切相關(guān)的發(fā)酵產(chǎn)品。選育優(yōu)良的乳酸菌發(fā)酵劑菌株對于生產(chǎn)高品質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)品至關(guān)重要。乳酸菌自身不能利用外源蛋白質(zhì)為菌體提供營養(yǎng)，必須利用自身的蛋白水解體系對外源蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，最終滿足對游離氨基酸的需要。乳酸菌的蛋白水解體系主要由胞外酶、轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和胞內(nèi)酶組成。其中胞外酶將外源蛋白質(zhì)(主要是酪蛋白)水解為多肽，這些多肽再由轉(zhuǎn)運系統(tǒng)運送至胞內(nèi)由胞內(nèi)酶水解成游離的氨基酸以供菌體的生長需要。其中胞內(nèi)酶的種類較多，主要有肽鏈內(nèi)切酶和端肽酶兩種。由此可見，乳酸菌的蛋白水解體系對于其自身的生長非常重要。因此，研究乳酸菌蛋白水解體系內(nèi)的關(guān)鍵酶的變化規(guī)律對于提高乳酸菌的品質(zhì)具有重要的意義。目前國內(nèi)外的學(xué)者都開始從分子生物學(xué)的角度對乳酸菌的蛋白代謝進(jìn)行深入研究，通過運用實時熒光定量PCR等方法檢測蛋白酶基因的表達(dá)情況。此外，研究人員還通過對乳酸菌的蛋白水解酶基因進(jìn)行基因修飾得到水解能力更強(qiáng)的發(fā)酵劑優(yōu)勢菌株［1］。

1 乳酸菌的蛋白水解體系

由于乳酸菌不能直接利用外源蛋白質(zhì)和無機(jī)氮源，必須通過降解外源蛋白質(zhì)或肽，以保證菌體正常生長代謝對氨基酸的需要。現(xiàn)乳酸菌已進(jìn)化到擁有一套完整的蛋白水解體系，對大分子酪蛋白進(jìn)行逐步降解，以滿足對氨基酸的需要。該蛋白水解體系主要包括三個部分:第一部分為將大分子酪蛋白水解成多肽的胞外蛋白酶;第二部分是將多肽轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)的多個轉(zhuǎn)運系統(tǒng);第三部分為將轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)的多肽進(jìn)一步水解成自由氨基酸的多種肽酶(圖1)，這些氨基酸最終進(jìn)行代謝或合成蛋白質(zhì)。

表 1 乳酸菌的肽酶［3，12］Table 1 The peptidases of the lactic acid bacteria［3，12］

圖1 乳酸菌的蛋白水解體系圖解［2］Fig.1 Schematic representation of the lactic acid bacteria proteolytic system［2］

目前，乳酸菌的蛋白水解體系在乳球菌中已經(jīng)得到了很好的研究［2-4］，并發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌的蛋白水解體系的結(jié)構(gòu)特征和乳球菌相似。研究發(fā)現(xiàn)，菌體對于肽的吸收要優(yōu)先于氨基酸的吸收。A Picon等人［5］對24株乳球菌的蛋白水解體系中相關(guān)酶的酶活進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其中18株菌中含有Opp和Dpp兩個轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，并且其活力較高。此外這些菌株還具有活力較高的肽酶。

由圖1可見，乳酸菌水解酪蛋白的蛋白水解體系的三個部分分別包括多種重要的酶。下面分別對這三個部分的組成及作用進(jìn)行綜述。

1.1 胞外酶

乳酸菌水解酪蛋白的第一步是通過胞外酶來實現(xiàn)的。胞外酶是一類將酪蛋白分解成多肽的蛋白酶。研究發(fā)現(xiàn)，胞外酶主要有PrtP、PrtB和 PrtS三種，其中PrtP主要存在于乳酸乳球菌，PrtB主要存在于保加利亞乳桿菌，PrtS主要來自嗜熱鏈球菌［6］。此外，瑞士乳桿菌中主要存在胞外酶基因為 PrtH，L Sadat-Mekmene等人［7］對瑞士乳桿菌中兩種胞外蛋白酶PrtH和PrtH2的活性進(jìn)行了研究，探討含有一種或兩種胞外蛋白酶的不同菌株對于外源蛋白質(zhì)的水解活性的差異。

1.2 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)

由胞外酶水解下來的多肽需要通過細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將其運送至胞內(nèi)，這也是乳酸菌水解酪蛋白的第二步。經(jīng)過研究證實，乳酸菌的多肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)有三種，分別是轉(zhuǎn)運二肽和三肽的Dtp P和Dtp T轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和轉(zhuǎn)運寡肽的Opp轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。其中DtpT和Dpp系統(tǒng)是單個蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)運親水性的二肽和三肽，但是由于二肽和三肽都不是由酪蛋白釋放的，因此轉(zhuǎn)運二肽和三肽的Dtp P和DtpT轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對乳酸菌的生長都是不必需的［8］。實驗證明不能表達(dá)編碼Opp系統(tǒng)的基因突變菌株不能轉(zhuǎn)運多肽，也不能在乳中生長。由此得出，第三種Opp寡肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對于乳酸菌的蛋白水解體系是最重要的。Opp轉(zhuǎn)運系統(tǒng)是由Opp復(fù)合體構(gòu)成，其屬于轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中的ABC(ATP結(jié)合盒)家族，它含有5個亞基:包括兩個轉(zhuǎn)運膜蛋白Opp B和Opp C，兩個ATP結(jié)合蛋白OppD和Opp F和一個膜連接底物結(jié)合蛋白OppA［9-10］。

1.3 肽酶

乳酸菌蛋白水解體系的第三步，是將轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)的多肽、二肽和三肽分解成游離的氨基酸，最終供菌體生長需要，這一步將由肽酶來實現(xiàn)。研究表明，肽酶大體分為內(nèi)肽酶和端肽酶兩種。內(nèi)肽酶也稱肽鏈內(nèi)切酶或蛋白酶，主要是水解蛋白質(zhì)和多肽鏈內(nèi)部的肽鍵，形成多種多肽和寡肽。端肽酶又稱肽鏈端解酶或外肽酶，主要是從肽鏈的一端開始水解，將氨基酸一個一個地從多肽鏈上分解下來。端肽酶根據(jù)其作用位置不同可分為氨肽酶、羧肽酶、二肽酶和三肽酶，氨肽酶是從肽鏈的氨基末端開始水解肽并釋放N端氨基酸的酶，而羧肽酶是從鏈的羧基末端開始水解肽鏈。此外，二肽酶和三肽酶(PepT)在乳酸菌蛋白水解體系中同樣具有非常重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，一些二肽酶屬于脯氨酰氨基酸二肽酶或氨?；彼岫拿福饕釴端或C端具有脯氨酸的肽［3，11］。表1列出一些關(guān)鍵的肽酶的名稱和作用位置。

由表1可以看出，不同的胞內(nèi)酶作用于多肽的位置大不相同，而相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)即使同一種肽酶也可能有不同的作用位置，如乳酸乳球菌中PepX除了能水解寡肽之外，還能水解二肽和一些不含脯氨酸的多肽［12］。

2 蛋白水解體系中相關(guān)基因的表達(dá)

2.1 檢測基因表達(dá)的方法

目前檢測基因表達(dá)的方法主要有Northern blot、RT-PCR、mRNA差異顯示、cDNA代表性差異分析和實時熒光定量PCR，這些都是從轉(zhuǎn)錄水平上對基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。其中實時熒光定量PCR是檢測基因表達(dá)量差異的最有效的方法之一，其可以對某一基因在不同樣本中的表達(dá)水平或在同一樣本經(jīng)過不同處理前后的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，此技術(shù)已被廣泛的用于各種基因在不同環(huán)境中的差異表達(dá)的研究［13］。

實時熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過特定數(shù)學(xué)原理對未知模板進(jìn)行定量分析的一種快速有效的方法。而普通PCR只能通過終點法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，而不能進(jìn)行定量分析，并且存在誤差［14］。定量PCR儀是在普通PCR儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測裝置，PCR擴(kuò)增和檢測同時進(jìn)行，最終結(jié)果不需進(jìn)行電泳檢測，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。實時熒光定量PCR分為絕對定量和相對定量。在定量的過程中涉及到一個非常重要的概念-CT值。CT(Cycle threshold)值是指熒光定量PCR每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，它與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系因此可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量。不同的實驗?zāi)康牟捎貌煌亩糠椒ǎ^對定量需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中某一基因的具體拷貝數(shù)或濃度。而相對定量一般應(yīng)用于比較不同樣本之間某一基因的表達(dá)量高低或是經(jīng)過不同處理的幾個樣本之間基因表達(dá)水平的高低變化。在相對定量中，必需選擇一個表達(dá)量恒定的內(nèi)源性管家基因(house keeping gene)作為內(nèi)參照物(簡稱內(nèi)參)，以管家基因的量來作為某種標(biāo)準(zhǔn)比較來源不同的樣本中目的基因表達(dá)量的差異，最終運用 2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析［15-16］。實時熒光定量PCR技術(shù)已被廣泛的用于乳酸菌在不同脅迫或是生長條件下基因差異表達(dá)的研究［17］。

2.2 乳酸菌蛋白水解體系中相關(guān)基因的表達(dá)情況

乳酸菌蛋白水解體系中部分相關(guān)基因已經(jīng)被檢出，其中乳酸球菌的三個不同的肽類轉(zhuǎn)運系統(tǒng)為:DtpT、DtpP和寡肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)Opp。乳酸桿菌關(guān)于肽類轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的研究要明顯少于乳酸球菌，只有Lactobacillus helveticus的一個轉(zhuǎn)運蛋白的基因DtpT被克隆并測序，并證實 Lactobacillus helveticus的DtpT轉(zhuǎn)運系統(tǒng)與Lactococcus lactis的DtpT轉(zhuǎn)運系統(tǒng)高度相似［18］。此外，Kirsi Peltoniemi等人［18］已經(jīng)克隆出Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus B14的Opp寡肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的基因。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，Opp的操縱子由OppD，OppF，OppB，Opp C和Opp A1五個基因組成。與此同時，通過基因比對發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌的Opp轉(zhuǎn)運系統(tǒng)與其他細(xì)菌的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和乳酸乳球菌的寡肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)存在高度的相似性。此外，HENRIKSEN等人［19］將部分肽酶基因克隆并轉(zhuǎn)入L.Lactis MG 1363中使其表達(dá)，制作成單一菌株發(fā)酵劑，結(jié)果表明，部分轉(zhuǎn)基因的發(fā)酵劑對于改善奶酪品質(zhì)有顯著影響。Leila Sadat-Mekmene等人［20］對Lactobacillus helveticus中蛋白水解體系做了簡要的介紹，并詳細(xì)論述了蛋白水解體系中的胞外酶編碼基因的最新信息以及胞外酶對于水解酪蛋白時的活性。M A Azcarate-Peril等人［21］研究了在脫脂乳中不同蛋白水解酶基因的差異表達(dá)，得出一些肽酶、轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的基因和PrtM、PrtP基因的表達(dá)量都是隨著菌體的生長而上升。Opp1基因的表達(dá)量在4h時達(dá)到最大，Opp2基因的表達(dá)量則隨著時間的延長不斷增長至12h時才達(dá)到最大，由此得出兩個轉(zhuǎn)運系統(tǒng)擁有不同的特征。Ji-Cheng Wang等人［22］利用實時熒光定量PCR技術(shù)研究了Lactobacillus casei Zhang在豆乳中生長時，其蛋白水解體系中相關(guān)基因的表達(dá)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與菌體生長到穩(wěn)定期時相比，在對數(shù)期時，胞外酶基因、轉(zhuǎn)運系統(tǒng)基因以及多種胞內(nèi)酶基因的表達(dá)量大都是顯著上調(diào)的。得出結(jié)論，蛋白水解體系在菌體的生長過程中起到了非常重要的作用。Rina Wu等人［23］同樣利用實時熒光定量PCR技術(shù)初步探討了在mRNA水平上一些肽酶基因在低酸環(huán)境下的表達(dá)變化情況，發(fā)現(xiàn)肽酶Pep P基因的表達(dá)量隨著pH的降低而下降。

Nicoline Vermeulen 等人［24］檢出了 Lactobacillus sanfranciscensis DSM 20451中編碼肽類轉(zhuǎn)運系統(tǒng)Opp和DtpT的基因和編碼胞內(nèi)酶 PepT、Pep R、PepC、PepN、Pep X的基因，并且發(fā)現(xiàn)除了 Pep X基因，L.Sanfranciscensis的肽類轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和一些胞內(nèi)肽酶的基因都是在發(fā)酵過程中得以表達(dá)。此外，Nicoline Vermeulen等人利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了L.Sanfranciscensis的 DtpT，Opp F，Pep C，PepR 和 Pep T基因在菌體不同生長階段表達(dá)的動態(tài)變化規(guī)律(見表2)。由表2可以看出，不同生長時期和肽供應(yīng)的不同對于pep T基因轉(zhuǎn)錄水平的影響要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對于dtp T和opp F基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。在未添加肽的發(fā)酵過程中，對數(shù)期OppF、DtpT和PepT的表達(dá)水平要明顯高于穩(wěn)定期，而在添加肽的發(fā)酵過程中，與對數(shù)期相比，穩(wěn)定期Opp F和Dtp T的表達(dá)水平都是降低的，但是PepT的表達(dá)水平卻是升高的。在發(fā)酵過程中隨著肽含量的增多，Opp和Dtp T基因的表達(dá)量減少17倍，而PepT基因的表達(dá)量則在較小的范圍內(nèi)依賴于肽的含量。因此，肽含量的高低是乳酸菌蛋白水解體系中相關(guān)基因表達(dá)水平的一個限制性因素。

表2 L.Sanfranciscensis DSM 20451在發(fā)酵生長過程中肽類轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和水解肽類的相關(guān)基因的表達(dá)情況Table 2 Expression of genes related to peptide transport and hydrolysis by L.sanfranciscensis DSM 20451 during growth in sourdough

從上述研究中可以看出，乳酸菌蛋白水解體系中轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和相關(guān)酶的基因已經(jīng)被檢出，并且國內(nèi)外學(xué)者正在利用分子技術(shù)研究這些基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)的變化規(guī)律。初步得出，菌體在不同生長階段時，蛋白水解體系中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平有顯著的差異，并且隨著菌體的不斷生長表達(dá)量呈下降趨勢。此外，乳酸菌蛋白水解體系中相關(guān)基因的表達(dá)水平還受肽含量的影響。至于培養(yǎng)過程中的其他因素對乳酸菌蛋白水解體系中相關(guān)基因的表達(dá)水平是否有影響還有待進(jìn)一步的研究。如能找到更多蛋白水解體系相關(guān)基因表達(dá)水平的限制性因素，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，使關(guān)鍵基因得到最大的表達(dá)量，就能從根本上提高菌體的品質(zhì)，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵劑菌株。在以后的研究中，應(yīng)該著重研究乳酸菌蛋白水解體系中相關(guān)基因的表達(dá)變化規(guī)律，從基因?qū)用嫔细淖儼l(fā)酵劑菌株的品質(zhì)。

3 結(jié)語

乳酸菌自身不能利用外源無機(jī)氮和蛋白質(zhì)，必需通過蛋白水解體系中的胞外酶將酪蛋白分解成多肽，再由Opp轉(zhuǎn)運系統(tǒng)運送至胞內(nèi)，通過胞內(nèi)的肽鏈內(nèi)切酶和端肽酶將各種多肽分解成游離的氨基酸以滿足菌體的生長需要，因此蛋白水解能力的強(qiáng)弱影響著乳酸菌的正常生長。

目前，很多對乳酸菌蛋白代謝的研究都已經(jīng)從分子的層面入手［25-29］，通過深入研究可從基因水平掌握乳酸菌的蛋白代謝機(jī)制，從而利用代謝調(diào)控手段提高乳酸菌的生長數(shù)量和代謝水平，推動乳酸菌研究的迅速發(fā)展，獲得高水平的發(fā)酵產(chǎn)品。

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