王 艷，冮 潔，金李玲，沈 冰，田朝杰，王 婷，閆卉新

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600)

羊肚菌(Morchella esculenta)隸屬子囊菌亞門(Ascomycotina)、盤 菌 綱 (Discomycetes)、盤 菌 目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)，因其菌蓋表面呈許多小凹坑，外觀極似羊肚而得名。羊肚菌是一種野生名貴食藥用真菌，因其具獨(dú)特的風(fēng)味、豐富的營養(yǎng)和重要的保健作用，有著廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景［1］。目前羊肚菌還不能實(shí)現(xiàn)商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，采用液體深層發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)羊肚菌菌絲體，不受環(huán)境因素的影響，易控制，效率高，價(jià)格便宜，適合工業(yè)化生產(chǎn)。并且深層發(fā)酵培養(yǎng)的真菌菌絲體與子實(shí)體在化學(xué)組成、生理功能上均很相似［2］。鋅是人體必需的微量元素之一，是許多金屬酶的組成成分或酶的激活劑。鋅缺乏在中國人群中普遍存在，嬰兒、兒童、孕婦和育齡婦女缺鋅尤其嚴(yán)重［3］。食品中以游離態(tài)存在的鋅不易被人體吸收，且一般游離態(tài)的金屬均具有一定毒性。利用真菌富集功能，將無機(jī)鋅與蛋白、糖等物質(zhì)結(jié)合成有機(jī)鋅蛋白和鋅多糖等大分子活性物質(zhì)，既避免了無機(jī)鋅的缺點(diǎn)，又更有利于有機(jī)鋅的免疫功能和食藥用菌的抗病功能的發(fā)揮［4］。所以，利用食用菌的富鋅能力，采用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)富鋅食用菌菌絲體可作為新型的補(bǔ)鋅劑。畢靜瑩［5］、鄧百萬［6］、張琪林［7］、黃仁術(shù)［4］和冮潔［8］等分別對姬松茸、豬苓、大球蓋菇、金針菇和真姬菇深層發(fā)酵富集鋅情況進(jìn)行了研究。本文首次對羊肚菌菌絲體富鋅能力進(jìn)行了考察，并對其液體發(fā)酵富鋅的適宜條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草(Cordyceps militaris)、大球蓋菇(Strophariarugoso-annulata)、鉚釘菇(Gomphidiaceae)、杏鮑菇(Pleurotus eryngii)、美味牛肝菌(Boletus edulis)、羊肚菌(Morehella esculenta)、靈芝(Ganoderma lucidum)和真姬菇(Hypsizygus marmoreus) 均購自朝陽市食用菌研究所;葡萄糖、瓊脂粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、醋酸鋅、氯化鋅等 以上試劑均為分析純或化學(xué)純;斜面和固體平板培養(yǎng)基(綜合PDA培養(yǎng)基)馬鈴薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀1.5g、硫酸鎂1.0g、瓊脂粉 20g、水 1000m L，pH 自然;液體培養(yǎng)基 不加瓊脂的綜合PDA培養(yǎng)基。

KDB-Ⅲ微波消解爐 青島科迪博電子科技有限公司;Z-2000火焰原子吸收光譜儀 日本日立公司;BS 223S電子精密天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;GRP-9080電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ZHJH-C2112B無菌操作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司;UV-2000紫外可見分光光度計(jì) UNICO;HYG-3多功能搖床 金壇市杰瑞爾電器有限公司;PHS-3EpH酸度計(jì) 雷磁。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將保存菌種用接種針接入斜面培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)7d。

1.2.2 菌絲體培養(yǎng) 液體菌種培養(yǎng):將活化的菌種接種在裝有100m L不加瓊脂的液體PDA綜合培養(yǎng)基的250m L三角瓶中，接種量為10%，28℃，150r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5d。菌絲體液體平板培養(yǎng)耐鋅能力:將蛹蟲草、大球蓋菇、鉚釘菇、杏鮑菇、美味牛肝菌、羊肚菌、靈芝、真姬菇分別接種到液體培養(yǎng)基和含ZnSO4為400mg/L的液體培養(yǎng)基中，25℃，150 r/m in振蕩培養(yǎng)5d。

1.2.3 羊肚菌液體發(fā)酵富鋅條件的優(yōu)化 參照文獻(xiàn)［8］因素水平的選擇，采用四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)研究裝液量、接種量、pH、培養(yǎng)時(shí)間對羊肚菌富鋅的影響。

表1 羊肚菌富鋅條件正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levers of the orthogonal test for Zinc-riching conditions of Morehella esculenta

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 菌絲體鋅含量的測定 微波消解-火焰原子吸收光譜法測定［9］。微波消解:稱取0.050g的粉狀干菌絲于消解罐中，加入消解劑(HNO35m L)，放入微波消解爐中，中火(528W)5m in，高火(800W)8m in，微波消解后，消解罐于冷水中冷卻15m in，去離子水沖洗消解罐內(nèi)壁，觀察消解效果，并將消解液定量轉(zhuǎn)入50m L的容量瓶中，用去離子水定容，定容后吸取1.0m L溶液移入50m L容量瓶，再用去離子水定容后用于Zn濃度測定?；鹧嬖游辗y定條件:工作燈電流5.0mA，光譜帶寬1.3nm，負(fù)高壓352V，燃?xì)饬髁?5000m L/min，燃燒器高度7.5mm，波長213.9nm。

1.2.3.2 菌絲體生物量的測定 取10m L發(fā)酵液于5000 r/m in離心20min，蒸餾水洗滌3次，60℃烘至恒重，分析天平稱重。

1.2.3.3 富鋅率的計(jì)算［10］根據(jù)公式計(jì)算富鋅率:

富鋅率(%)=［富鋅菌絲體鋅含量(μg/g)-空白菌絲體鋅含量(μg/g)］×富鋅菌絲體干重(g/100m L)/培養(yǎng)基內(nèi)鋅含量(μg/100m L)×100

1.2.3.4 菌絲體富鋅有機(jī)化程度測定 采用持續(xù)透析法［11］。精確稱取0.5g富鋅菌絲體，在雙蒸水中反復(fù)透析，直至用茚三銅法檢驗(yàn)透析液中無氨基酸為止，測定菌絲體中含鋅量。有機(jī)化程度指菌絲體中有機(jī)鋅與總鋅含量的比值。

表2 食用菌菌絲體固體平板培養(yǎng)耐鋅能力Table 2 The capacities of Zn-resisting of the mushoom in the solid medium

2 結(jié)果與討論

2.1 食用菌菌絲體固體培養(yǎng)耐鋅能力的實(shí)驗(yàn)

由表2可以看出:大球蓋菇和靈芝的富鋅平板與無鋅平板處理間無顯著差異(p＞0.05);蛹蟲草、鉚釘菇、美味牛肝菌、羊肚菌、真姬菇的富鋅平板與無鋅平板處理間有顯著差異(p＜0.05)。羊肚菌菌絲體在相同時(shí)間內(nèi)生長速度最快，耐鋅能力最強(qiáng)。

2.2 食用菌液體培養(yǎng)耐鋅能力的實(shí)驗(yàn)

測定菌絲體的生物量、鋅含量和富鋅率，結(jié)果見表3。

表3 食用菌液體培養(yǎng)耐鋅能力Table 3 The capacities of Zn-resisting of the mushoom in the liquid medium

通過表3食用菌液體培養(yǎng)耐鋅能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，生物量大小順序?yàn)?大球蓋菇＞靈芝菌＞羊肚菌＞蛹蟲草＞美味牛肝菌＞鉚釘菇＞真姬菇＞杏鮑菇;鋅含量大小順序?yàn)?真姬菇＞鉚釘菇＞杏鮑菇＞羊肚菌＞蛹蟲草＞大球蓋菇＞美味牛肝菌＞靈芝菌;富鋅率大小順序?yàn)?真姬菇＞鉚釘菇＞羊肚菌＞蛹蟲草＞大球蓋菇＞美味牛肝菌＞靈芝菌＞杏鮑菇。羊肚菌液體培養(yǎng)生長速度快、耐鋅和富鋅能力較強(qiáng)。因此，選擇羊肚菌作為食用菌富鋅實(shí)驗(yàn)的載體。

2.3 羊肚菌富鋅實(shí)驗(yàn)適宜鋅源的篩選

分別配制 Zn(CH3COO)2、ZnSO4、ZnCl2的液體培養(yǎng)基，在25℃，150 r/m in條件下振蕩培養(yǎng)5d。測定菌絲體含鋅量，結(jié)果見表4。通過羊肚菌鋅源篩選，富鋅率的大小為:Zn(CH3COO)2＞ZnCl2＞ZnSO4。因此，選擇Zn(CH3COO)2作為實(shí)驗(yàn)的鋅源。

表4 羊肚菌鋅源篩選Table 4 The screen of Zinc source of Morehella esculenta

2.4 羊肚菌富鋅適宜濃度的篩選

Zn(CH3COO)2作為羊肚富鋅的鋅源，分別配制鋅濃度為 100、200、300、400、500、600、700、800mg/L的液體培養(yǎng)基，在25℃，150 r/m in條件下振蕩培養(yǎng)5d。測定菌絲體含鋅量，計(jì)算富鋅率，結(jié)果見表5，當(dāng)鋅濃度為600mg/L時(shí)，羊肚菌富鋅率最高。因此，選擇600mg/L作為下一步實(shí)驗(yàn)鋅添加濃度。

表5 羊肚菌富鋅濃度篩選Table 5 The screen of Zinc concentration of Morehella esculenta

2.5 羊肚菌液體發(fā)酵富鋅條件的優(yōu)化

由表6正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，以富鋅率為目標(biāo)值的實(shí)驗(yàn)因素影響的主次順序?yàn)?A(裝液量)＞C(pH)＞B(接種量)＞D(時(shí)間)，最優(yōu)組合為:A1B1C2D2，即裝液量 50m L、接種量 5%、pH7、培養(yǎng)時(shí)間4d。經(jīng)對優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，羊肚菌具有較強(qiáng)的富鋅能力，富鋅率可達(dá)23.20%。

2.6 富鋅有機(jī)化程度的比較與分析

除去菌絲體上粘附的培養(yǎng)基中的醋酸鋅和菌絲體中的無機(jī)鋅，測定有機(jī)鋅的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

從表7可看出，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加鋅濃度為600mg/L時(shí)，羊肚菌菌絲體的總富鋅率可達(dá)25.93%，但其中只有37.71%轉(zhuǎn)化為有機(jī)鋅，因此，羊肚菌菌絲體有機(jī)鋅的富鋅率為9.78%。培養(yǎng)基中的無機(jī)鋅是通過與菌絲體中的蛋白質(zhì)、多糖等大分子結(jié)合而形成有機(jī)鋅的。

表6 羊肚菌富鋅條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 6 The results of orthogonal test for for Zinc-riching conditions of Morehella esculenta

表7 羊肚菌菌絲體富鋅有機(jī)化程度Table 7 The degree of Zinc organic of Morehella esculenta mycelium

3 結(jié)論

礦質(zhì)元素在食用菌中大部分以有機(jī)態(tài)存在，具有良好的穩(wěn)定性，便于儲(chǔ)存、運(yùn)輸及更好的與其他成分配伍，其中大部分與蛋白質(zhì)，糖和脂肪類物質(zhì)結(jié)合，有利于礦質(zhì)元素的吸收和利用［12］。羊肚菌菌絲體具有較強(qiáng)的耐鋅能力和富鋅能力，優(yōu)化的羊肚菌菌絲體富鋅條件為:發(fā)酵溫度25℃，起始pH7，振蕩轉(zhuǎn)速150r/min，250m L三角瓶裝液50m L，鋅添加量為600mg/L，接種量5%，培養(yǎng)時(shí)間4d。在此條件下，羊肚菌菌絲體的生物量及含鋅量達(dá)最高，富鋅率可達(dá)23.20%。羊肚菌菌絲體具有很強(qiáng)的富鋅能力，豬苓菌絲體的富鋅率為16.7%［6］，金針菇菌絲體的富鋅量是 42.43mg/g［4］，真姬菇菌絲體富鋅率為 7.98%［8］，靈芝菌絲體的含鋅量高達(dá)25.09mg/g［13］。適宜羊肚菌富鋅的鋅源是Zn(CH3COO)2，不同的鋅源對食用菌菌絲體富鋅會(huì)產(chǎn)生不同的影響。根據(jù)黃仁術(shù)等人［4］的研究結(jié)果液體培養(yǎng)金針菇富鋅Zn(CH3COO)2作為鋅源要比 ZnSO4、ZnCl2利用率高。因?yàn)?Zn(CH3COO)2是弱酸弱堿鹽，它可以使菌絲與鋅在適宜的、穩(wěn)定的環(huán)境中絡(luò)合和生長。羊肚菌菌絲體富鋅條件的研究為開發(fā)新型功能食品鋅強(qiáng)化劑奠定了基礎(chǔ)。

［1］王波.羊肚菌人工栽培新技術(shù)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2005，5(1):3-8.

［2］鄧超，鄔敏辰.食用菌深層發(fā)酵及其多糖活性研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(15):4622-4625.

［3］秦義.富鋅靈芝液體種子培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16(1):153-156.

［4］黃仁術(shù).液體培養(yǎng)富鋅金針菇鋅源與鋅添加量的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(12):48-51.

［5］畢靜瑩，盧麗娟，秦義，等.富鋅靈芝發(fā)酵培養(yǎng)條件的響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19(7):113-118.

［6］鄧百萬，陳文強(qiáng).豬苓菌絲液體培養(yǎng)及富鋅研究［J］.中國食用菌，2002(22):33-34.

［7］張琪林，王紅.大球蓋菇液體培養(yǎng)富鋅特性研究［J］.農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2007，27(5):58-59.

［8］冮潔，金京慧.真姬菇菌絲體液體發(fā)酵富鋅條件的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(6):226-228.

［9］湛方棟，何永美，陳建軍，等.微波消解-火焰原子吸收光譜法測定真菌菌絲Cd含量［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2010，29:215-218.

［10］賈樂，于克學(xué)，姚良同，等.富鋅冬蟲夏草菌絲體有機(jī)化程度及氨基酸含量分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(11):95-98.

［11］董學(xué)衛(wèi)，朱啟忠，郭錦.大綠菇菌絲體富鋅能力的研究［J］.食品與機(jī)械，2007，23(5):17-22.

［12］劉文群，鄧澤云，徐爾尼，等.保加利亞乳桿菌對微量元素硒、鉻、鋅的富集［J］.食品科技，2006，3(2):135-137.

［13］魏賽金，程新，涂曉嶸.靈芝液體發(fā)酵富集鋅離子研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(1):242-244.