高 媛，周先漢，曾慶梅，吳克平，鄒旭鵬

（1.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏銀川750021；2.合肥工業(yè)大學(xué)分析測試中心，安徽合肥230009；3.合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥230009）

高壓CO2殺菌技術(shù)（High Pressure Carbon Dioxide，簡稱HPCD）作為一種新興的“冷殺菌”（又稱非熱殺菌）技術(shù)受到廣泛關(guān)注[1]。高壓CO2殺菌技術(shù)在有效的殺滅微生物保證食品貯藏安全的同時，又能滿足廣大消費者對于食品新鮮、健康、安全的要求。和具有“冷殺菌”美譽的超高壓滅菌（400～1000MPa）技術(shù)相比，高壓CO2殺菌技術(shù)操作壓力相對較低，一般只需3～70MPa，同時隨著高壓CO2的設(shè)備改進、成本降低及殺菌機理的明確，其在食品加工領(lǐng)域的發(fā)展前景更加廣闊[2-5]。高壓CO2殺菌技術(shù)已經(jīng)在液體食品中取得了良好的殺滅微生物的作用。在壓力低于50MPa，溫度5～60℃之間進行的高壓CO2處理可以實現(xiàn)對微生物2～12個對數(shù)級的殺滅效果[6]，至少有12種革蘭氏陽性菌，10種革蘭氏陰性菌，8種細菌芽孢以及8種真菌菌絲體或孢子被用來進行高壓CO2處理殺菌的實驗研究[7-9]，在適當(dāng)?shù)臏囟群蛪毫ο?，單純高壓CO2處理能夠顯著地殺滅細菌的營養(yǎng)體。然而在室溫下，高壓CO2處理對于細菌芽孢的殺滅效果不夠理想[10-13]。由于芽孢的高耐熱性和其他抗性，因此，是否能夠殺滅一些代表菌的芽孢就成了衡量各種消毒手段的最重要的指標(biāo)。芽孢殺滅的指示菌——枯草芽孢桿菌具有芽孢結(jié)構(gòu)，孢子較為耐熱耐壓，用高壓CO2對其孢子較為難殺滅。當(dāng)芽孢一旦萌發(fā)生長為營養(yǎng)體后，則其抗熱抗壓能力下降，與非芽孢菌的菌體類似，較易殺滅[14-15]。本文以枯草芽孢桿菌為研究對象，通過高壓CO2處理實驗，考察其在不同壓力和溫度組合條件下的致死作用，結(jié)合響應(yīng)曲面法的Box-Behnken模式，建立枯草芽孢桿菌高壓CO2殺菌模型，優(yōu)化殺菌工藝參數(shù)，為高效殺滅芽孢菌奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）編號：20622，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）；高壓氣體 實驗選用高壓CO2氣體作為實驗選用的殺菌介質(zhì)，氣體純度為99%，CO2氣瓶壓力為5～6MPa，由合肥恒隆電氣技術(shù)有限公司提供；固體培養(yǎng)基 普通營養(yǎng)瓊脂（蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL），調(diào)pH7.0～7.2，121℃高壓滅菌15min；促芽孢生長培養(yǎng)基[16]在上述固體培養(yǎng)基中加入MnCl2（培養(yǎng)基中Mn2+的濃度為50mg/L），調(diào)pH后混勻，滅菌備用；液體培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯（蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL），加入3%硫酸錳溶液，混勻，121℃高壓滅菌15min。

HA121-50-01-C高壓CO2殺菌裝置 如圖1所示，最高壓力50MPa，單缸容積1L，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司生產(chǎn)；TDL-50B臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-25B型數(shù)字酸度計 上海大普儀器有限公司；721分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；微生物實驗常規(guī)儀器。

圖1 高壓CO2殺菌設(shè)備工藝流程圖Fig.1 Schematic diagram of high pressure CO2sterilization

1.2 實驗方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌萌發(fā)處理 為保證枯草芽孢桿菌芽孢一定的形成率，在100mL液體培養(yǎng)基中接入枯草芽孢桿菌，（30±1）℃、150r/min培養(yǎng)18h，用接種環(huán)挑取第1代的菌懸液，30℃下于固體培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)18h，染色后顯微鏡檢（芽孢專用染色法），要求芽孢形成率在90%～95%以上。4000r/min離心30min，棄上清液，加無菌蒸餾水沖洗離心，重復(fù)2～3次；將洗凈的芽孢懸浮于滅過菌的磷酸鉀緩沖液（PBS，0.2mol/mL，pH7.2）中，調(diào)細胞濃度為108～109CFU/mL[17]。熱力和壓力協(xié)同能夠有效地促進芽孢的萌發(fā)，結(jié)合實驗結(jié)果并考慮到具體的應(yīng)用，選擇協(xié)同溫度60℃，壓力10MPa，對芽孢懸液進行40min的高壓CO2處理，促使芽孢萌發(fā)，隨后驗證高壓CO2改變殺菌參數(shù)時的殺菌效果。

1.2.2 樣品的高壓CO2處理 實驗前，于無菌操作臺上，將制好的枯草芽孢桿菌孢子懸液接種于pH為7.2的磷酸鹽緩沖液中，并調(diào)整含菌量為107CFU/mL。將菌懸液加入釜內(nèi)，通入CO2先趕走釜內(nèi)殘存的空氣，然后向高壓釜內(nèi)通入CO2至所需壓力（升壓時間控制在30s左右），按照實驗要求保壓一定時間后，從放料口出料。

1.2.3 微生物數(shù)量的測定 采用平板計數(shù)法（GB 4789-2003）進行菌落計數(shù)，以無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋處理后和未處理（對照組）的芽孢菌懸液，于營養(yǎng)瓊脂平板上37℃培養(yǎng)48h后，計菌落數(shù)。重復(fù)3次，計平均數(shù)。

式中：N—經(jīng)過高壓CO2處理后，芽孢在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)可見的菌落總數(shù)，CFU/mL；N0—未經(jīng)過高壓CO2處理前的菌落總數(shù)，CFU/mL。

1.2.4 高壓CO2致死枯草芽孢桿菌的響應(yīng)曲面法分析 采用Box-Behnken模式，以萌發(fā)后的枯草芽孢桿菌為實驗對象，以壓力、溫度和保壓時間為自變量（independent variable），實驗優(yōu)化，建立高壓CO2殺滅枯草芽孢桿菌殺菌效果模型。

結(jié)合現(xiàn)有實驗條件及相關(guān)研究報道[17]，確定壓力、溫度和保壓時間三個因子的取值范圍分別為10～30（步長10）MPa、10～50（步長20）℃和30～90（步長30）min。根據(jù)xi（Xi-Xi0）/ΔXi對自變量進行編碼（xi為自變量的編碼值；Xi為自變量的真實值，其中i=1，2，3；Xi0為實驗中心點處自變量的真實值；ΔXi為自變量變化步長）。實驗自變量因素編碼及水平見表1。高壓CO2對枯草芽孢桿菌的殺滅對數(shù)值Y（致死率）為響應(yīng)值（Y=-lgNi/N0，其中Ni為高壓CO2處理后1mL菌液中活菌數(shù)，N0為未處理的對照組1mL菌液中的活菌數(shù)）。采用Design Expert 7.1.0軟件進行實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。

表1 實驗自變量因素編碼及水平Table 1 Codes and levels of factors chosen for the trials

2 結(jié)果與討論

2.1 高壓CO2致死枯草芽孢桿菌回歸模型的建立

采用統(tǒng)計軟件Design-Expert 7.0進行實驗設(shè)計，并優(yōu)化出17組實驗，實驗結(jié)果見表2。為了確保實驗結(jié)果的科學(xué)性，隨機挑選表2中的組別進行實驗，不刻意按照其實驗號順序進行實驗。通過回歸分析得到多元二次回歸模型：

對模型進行方差分析，結(jié)果見表3。由表中可以看出：模型F模型=127.87＞F0.01（9，4）=14.66，模型p＜0.0001，表明模型極顯著，F(xiàn)失擬=2.74＜F0.05（9，3）=8.81，失擬項p=0.1772＞0.05，模型失擬度不顯著。模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.9862，說明該模型能夠解釋98.62%響應(yīng)值的變化，因而模型擬合程度良好，實驗誤差小，可以用此模型對高壓CO2殺滅枯草芽孢桿菌進行分析和預(yù)測。

表2 實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design arrangement and responses

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for regression equation

回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表4。由表4可知，模型中檢驗項p值小于0.0500，則該項顯著，否則該項不顯著。模型中一次項壓力X1、溫度X2、時間X3、二次項達到極顯著水平（p＜0.0001）、X1X2達到顯著水平（p＜0.05）；（p=0.0819）、交互項X1X3（p=0.1241）、X2X3（p=0.6059）不顯著。

其中自變量X2X3影響不顯著（p＞0.25），進行回歸方程的優(yōu)化，剔除不顯著的影響因素X2X3，重新進行回歸分析，剔除后的方差分析見表5。

方差分析表明，各因素對致死率的影響大小順序為：X2＞X1＞X3；剔除不顯著系數(shù)后，除交互項X1X2（p=0.1241）以及二次項（p=0.1772）不顯著，各因素回歸系數(shù)達到顯著水平，新的回歸方程為：

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Test of significance for regression coefficients

表5 偏回歸系數(shù)檢驗方差分析表Table 5 Test of significance for regression coefficients

2.2 壓力與溫度因素對枯草芽孢桿菌致死率的響應(yīng)曲面

圖2 Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面Fig.2 Response surface of Y=f（X1，X2）

圖2為X3=0水平（保壓時間60min）時，壓力與溫度兩因素的響應(yīng)曲面。在壓力（X1）為10～30MPa，溫度（X2）10～50℃的響應(yīng)曲面中可以看到：在壓力固定不變的情況下，隨著溫度的增加，枯草芽孢桿菌致死率有顯著的提高。在溫度固定不變的情況下，隨著壓力的增加，致死率有所增加，但增加的幅度較小。

2.3 壓力與時間因素對枯草芽孢桿菌致死率的響應(yīng)曲面

圖3為固定溫度X2=30℃條件下在不同壓力和時間處理下枯草芽孢桿菌致死率變化情況。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，壓力（p＜0.001）和時間（p＜0.001）都是枯草芽孢桿菌致死的顯著影響因素，兩者交互作用不顯著。從壓力和時間因素的響應(yīng)曲面圖中可以看出，在時間固定不變的情況下，隨著壓力的增加，致死率增加；在壓力固定不變時，延長保壓時間可以緩慢增加枯草芽孢桿菌的致死率。

圖3 Y=f（X1，X3）的響應(yīng)曲面Fig.3 Response surface of Y=f（X1，X3）

2.4 溫度與時間因素對枯草芽孢桿菌致死率的響應(yīng)曲面

圖4 Y=f（X2，X3）的響應(yīng)曲面Fig.4 Response surface of Y=f（X2，X3）

圖4為X1=0水平時，即固定壓力為20MPa的條件下，溫度與時間對枯草芽孢桿菌致死率的影響。在溫度（X2）為10～50（步長為10）℃，保壓時間（X3）為30～90（步長為15）min變化的響應(yīng)曲面圖中可以看到：在壓力處于20MPa水平下，時間固定不變的情況下，隨著溫度的增加，致死率不斷提高；而當(dāng)溫度固定不變時，隨著溫度的增加致死率提高的很緩慢。溫度與時間因素處于最高水平時能夠達到4.7個對數(shù)值的殺菌率。要想提高殺滅效果,必須提高溫度。

2.5 高壓CO2殺菌最佳條件的優(yōu)化

考慮到高壓CO2在食品工業(yè)中的實際應(yīng)用，由式（2）回歸方程預(yù)測殺滅枯草芽孢桿菌的最佳條件。采用統(tǒng)計軟件Design Expert軟件模擬尋優(yōu)預(yù)測出10組殺菌效果好的工藝參數(shù)進行驗證，表中所列各參數(shù)值為控制目標(biāo)值，波動范圍分別為壓力±2MPa，溫度±1℃，時間±1min。結(jié)果見表6。

由表6可以看出，回歸模型預(yù)測優(yōu)化出的10組殺滅效果較好的工藝參數(shù)其殺滅效果預(yù)測值最高能夠達到5.44個數(shù)量級，最低4.82個數(shù)量級。工藝參數(shù)的取值范圍是：壓力X1為22.55～30.00MPa，溫度X2為37.17～50℃，時間X3為36.42～90min?？紤]到最大限度的保留食品的營養(yǎng)和風(fēng)味，節(jié)約能源，將高壓CO2殺滅枯草芽孢桿菌的殺菌優(yōu)化工藝參數(shù)確定為：壓力30MPa，溫度48℃，時間90min。驗證實驗測得的枯草芽孢桿菌殺滅對數(shù)值為5.22，與模型預(yù)測值相差4.04%。實驗平均相對誤差為2.32%；因此，采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法建立的回歸模型準確可行，優(yōu)化得到的工藝參數(shù)可以應(yīng)用。

表6 回歸模型優(yōu)化的10組殺菌工藝參數(shù)及結(jié)果驗證Table 6 Verified results of sterilized process parameters of optimum ten groups from regression equation

3 結(jié)論

以枯草芽孢桿菌為主要研究對象，采用響應(yīng)曲面法中的Box-Behnken設(shè)計，進行了對已部分萌發(fā)枯草芽孢桿菌的高壓CO2殺滅效果優(yōu)化實驗，結(jié)果表明，各因素對殺滅效果的影響大小順序為溫度（X2）＞壓力（X1）＞時間（X3）。對殺菌對數(shù)值的響應(yīng)變化進行建模分析，建立了殺菌效果模型，在實驗條件范圍內(nèi)建立的的回歸模型準確有效，可以用于預(yù)測實驗條件范圍內(nèi)的殺滅對數(shù)值，可為殺菌工藝參數(shù)的選擇提供參考。通過對所建立的回歸模型優(yōu)化得出的10組實驗條件進行驗證，在壓力30MPa，溫度48℃，時間90min的條件下進行高壓CO2處理，達到5.22個殺滅對數(shù)值的效果，與模型預(yù)測值相差4.04%。

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