趙云玲，龔小見，周欣，*，陳華國，趙超

（1.貴州師范大學天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州貴陽 550001；2.貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州貴陽 550001）

芹菜（Apium graveolens L.）屬傘形花科一年或兩年生草本植物，有西芹、旱芹等品種。芹菜不僅具有食用價值，而且是一種“藥食同源”的綠色天然產(chǎn)物。傳統(tǒng)醫(yī)藥認為，芹菜有“甘涼清胃、滌熱祛風、補血健脾、止咳利尿、降壓鎮(zhèn)靜、利口齒咽喉、養(yǎng)精益氣、明目”等功用[1]。芹菜中含有豐富的黃酮類化合物，具有降壓安神、降血脂、保護血管和增強免疫力的功能。醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)是對人體具有生理活性的一類物質(zhì)，曾被稱為維生素P[2]，具有抗氧化、抗衰老[3]、增強機體免疫力、防癌抑癌等功能，提取和測定芹菜內(nèi)的黃酮類物質(zhì)對更有效地開發(fā)利用該藥用植物資源能起到一定的指導作用[4]。文獻報道對黃酮類物質(zhì)的提取方法主要有超聲法、溫浸法、回流法、超臨界CO2萃取法以及微波輔助萃取法[3-6]。本論文對芹菜中黃酮類化合物進行了提取工藝的研究，旨在為芹菜的進一步開發(fā)與應(yīng)用提供基礎(chǔ)科學參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

紫外-可見分光光度計（Cary-100型）：美國瓦里安公司；石英比色皿（1 cm）；電子天平（AL 204型）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK–98-Ⅱ型）：天津市泰斯特儀器有限公司；真空干燥箱（DF-6020）：杭州藍天化驗儀器廠；超聲儀（KQ 5200E型）：昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.2 試劑

芹菜購買于貴陽市煤礦村蔬菜市場，經(jīng)天然藥物質(zhì)量控制研究中心陳華國老師鑒定；蘆丁對照品：貴州迪大；其余試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮的提取與測定

芹菜清洗去雜后，晾干粉碎，精密稱取芹菜粗粉2.00 g，置250 mL錐形瓶中，加入一定量，一定濃度的乙醇溶液，在一定溫度下以一定的方式提取，冷卻，過濾，濾液于50℃水浴中蒸發(fā)濃縮至呈黏稠膏狀，移至真空干燥箱內(nèi)50℃干燥2 h，取出，冷卻至室溫，稱重，得浸膏質(zhì)量。

浸膏用甲醇溶解，于25 mL容量瓶中定容，室溫下超聲處理5 min，使之盡可能溶解。之后移取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，加入甲醇至12 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，置5 min；加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，置5 min；加入4%NaOH溶液10 mL，定容至刻度，搖勻置15 min，于510 nm波長測定。

1.2.2 標準曲線的繪制

精密稱取120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品20 mg于100 mL容量瓶中，甲醇定容，得0.2 mg/mL的標準儲備液。

分別量取 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 標準儲備液于25 mL容量瓶中，加入甲醇至12 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL置5 min，加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，置5 min，加入4%NaOH溶液10 mL，定容至刻度，搖勻置15 min，標準系列濃度依次為0.008、0.016、0.024、0.032、0.040 mg/mL。同法做試劑空白。

以空白溶液作參比，于510 nm波長測定吸光度，以吸光度對濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。得回歸方程y=19.738x-0.005 7，R2=0.999 2，表明吸光度與蘆丁濃度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3 方法學考察

分別研究不同溶劑濃度、提取溫度、提取時間、提取方式、料液比對芹菜總黃酮提取率的影響。

1.2.4 總黃酮提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗表進行正交試驗，優(yōu)化芹菜中總黃酮提取的工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑濃度考察

精密稱取2.000g芹菜粉末5份，分別用20%、40%、60%、80%、100% 的乙醇溶液以 1∶50（g：mL）的料液比加入錐形瓶中，混勻，85℃水浴加熱回流提取總黃酮，試驗結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對提取工藝的影響Fig.1 Effects of ethanol concentrations on extracting process

由圖1可見，乙醇濃度以40%為最佳，這可能是因為芹菜中黃酮為多種化合物的混合物，包括各種黃酮苷和苷元，這些物質(zhì)由于極性和化學結(jié)構(gòu)不同，在不同極性的提取溶劑中的溶解度也不盡相同。試驗表明，體積分數(shù)為40%的乙醇溶液相對于其它濃度能更好地提取出芹菜中的黃酮類化合物。

2.2 提取方式考察

2.2.1 回流法

精密稱取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇為溶劑，料液比 1∶50（g∶mL），85 ℃ 水浴回流提取總黃酮。

2.2.2 超聲法

精密稱取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇為溶劑，料液比 1∶50（g∶mL），功率 200 W，時間 25 min，60 ℃ 超聲提取。

2.2.3 溫浸法

精密稱取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇為溶劑，料液比 1∶50（g∶mL），45 ℃ 恒溫浸提總黃酮見圖 2。

圖2 不同提取方式對提取工藝的影響Fig.2 Effect of different extracting methods on extracting process

不同提取方式對芹菜中總黃酮的提取工藝也有影響，在回流、溫浸、超聲三種方式中，以回流效果較佳。這可能是由于部分黃酮類物質(zhì)在超聲過程中結(jié)構(gòu)被破壞，從而導致超聲效果較差，而溫浸法則可能由于黃酮類物質(zhì)在此過程中未被溶出，因此提取效果不佳。

2.3 提取溫度考察

精密稱取2.00 g芹菜粉末5份，以40%乙醇為溶劑，分別在 55、65、75、85、95℃ 條件下回流提取總黃酮，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對提取工藝的影響Fig.3 Effects of extracting temperatures on extracting process

由圖3表明：溫度不同，提取的總黃酮的含量不同。在65℃和85℃時總黃酮的提取率相差無幾，綜合考慮溫度太高可能使黃酮發(fā)生氧化，且雜質(zhì)溶出較多，并增加能耗等因素，因此選最佳提取溫度為65℃。

2.4 料液比考察

精密稱取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇為溶劑，固液比分別為 1∶8（g∶mL），1∶10（g∶mL），1∶12（g∶mL），1∶15（g∶mL），1∶18（g∶mL），并于 65 ℃ 回流提取，結(jié)果如圖4。

圖4 料液比對提取工藝的影響Fig.4 Effects of solid liquid ratios on extracting process

從圖4中可看出隨著固液比的降低，提取的總黃酮含量隨之增大，但當固液比達到 1∶15（g∶mL）后，黃酮的提取率增加不明顯，考慮到提取劑用量和提取液蒸發(fā)濃縮時的能源消耗，固液比以1∶15（g∶mL）為宜。

2.5 提取時間考察

精密稱取2.00 g芹菜粉末，以40%乙醇為溶劑，料液比為 1 ∶15（g∶mL），于 65 ℃回流提取，時間分別為0.5、1、2 、3 h，實驗結(jié)果如圖 5。

圖5 提取時間對提取工藝的影響Fig.5 Effects of extracting time on extracting process

從圖5可以看出，提取時間為1 h時提取效果比較理想，耗時短且提取率高，能較好的應(yīng)用于實際生產(chǎn)中，因此考慮最佳提取時間為1 h。

2.6 總黃酮提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

為全面考察影響因素，基于單因素試驗的結(jié)果，對影響提取效果的主要因素設(shè)計了三因素三水平的正交試驗。試驗因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2（其中D項為空白列），方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal test

表2L9（34）正交試驗結(jié)果Table 2Results for the orthogonal text L9（34）

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis of variance

由表2和表3可以看出，各因素對黃酮提取率均有顯著性影響，依次為料液比＞回流時間＞提取次數(shù)，綜合考慮，確定最佳工藝條件為A3B2C3。即以料液1 ∶18（g∶mL），每次 1 h，提取 3 次提取效果最佳。

2.7 優(yōu)化工藝的驗證

由于優(yōu)選的工藝未包含在正交設(shè)計表的9次試驗中，故對其進行了驗證試驗，結(jié)果見表4。

表4 優(yōu)化工藝條件的驗證結(jié)果Table 4 Results for the text of optimum process

用同一批藥材，按條件A3B2C3進行三次重復試驗，總黃酮含量穩(wěn)定在3.5左右，RSD為0.19%，表明此優(yōu)化工藝穩(wěn)定、可行。

正交試驗中部分試驗測定的總黃酮的含量高于驗證試驗結(jié)果，但是差異不大，考慮到實際生產(chǎn)中時間寶貴、節(jié)約成本的問題，還是以正交試驗優(yōu)選的工藝條件為準。

3 討論

3.1 加標回收率試驗

為檢驗測定方法的準確性，對樣品進行加標回收率試驗，準確移取“1.2.1”項下的上清液1.0 mL 9份，分別加入濃度為0.0078 mg/mL標準溶液0.5、2.0、2.5 mL各3份，定容顯色測定吸光度，結(jié)果表明，加入3種不同含量的標準溶液，樣品加標回收率均在97%以上，回收率RSD為1.5%，說明試驗方法是可行的。

3.2 精密度試驗

按試驗方法對濃度為0.060 mg/mL的蘆丁標準溶液進行6次測定，相對標準偏差（RSD）為1.7%，表明儀器精密度良好。

表5 樣品加標回收率測定結(jié)果Table 5 Results for the text of recovery

3.3 重復性試驗

稱取同一批次芹菜粉末，按“1.2.1”項下方法制備4份，并進行含量測定，計算芹菜中總黃酮含量。結(jié)果R.S.D.為2.07%，表明方法重現(xiàn)性良好。

4 結(jié)論

黃酮類化合物的提取，文獻報道大多為溶劑萃取法、超聲法、微波法、堿提酸沉法、碳吸附法提取、超臨界CO2流體萃取法，結(jié)合黃酮類物質(zhì)為親水性有機溶劑，本實驗以乙醇為溶劑考察了超聲法、溫浸法、熱回流法等提取方式，同時對乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間做了單因素考察，又設(shè)計正交試驗綜合考察了料液比、提取時間和提取次數(shù)，又做了驗證性試驗、加標回收率試驗，考察了精密度、重現(xiàn)性，從而確定芹菜中總黃酮的最佳提取工藝：乙醇濃度為40%，溫度為 65℃，料液比為 1∶18（g∶mL），熱回流提取 3次，每次1 h。

這一最佳提取工藝的獲得對提高芹菜中總黃酮的提取率具有一定的參考價值，為芹菜的綜合開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。

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[1]董麗花,范增民.不同品種芹菜不同部位微量元素含量研究[J].微量元素與健康研究,2004,21(3):26－27

[2]高金燕,陳紅兵.芹菜中活性成分的研究進展[J].中國食物與營養(yǎng),2005(7):28－31

[3]張桂,暢天獅,劉俊果,等.從芹菜中提取黃酮類物質(zhì)的研究[J].食品科學,2002,23(8):121－125

[4]許琦.芹菜總黃酮的提取及含量測定[J].食品科技,2006(7):241－243

[5]鄒玉紅,寇小燕,韓秋霞.超聲波輔助提取甘草總黃酮及其抗氧化性[J].食品研究與開發(fā),2011,32(9):79－81

[6]夏其樂,鄭美瑜,楊穎,等.胡柚皮總黃酮超臨界CO2萃取工藝[J].農(nóng)業(yè)機械學報,2011,42(9):151－154